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日本同仁化学研究所 请在使用前仔细阅读说明书 DNA损伤定量试剂盒-AP位点计数- 5 samples，20 samples 目录 一、产品描述‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 五、注意事项‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 4 二、试剂盒内含‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 六、QA ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 4 三、所需设备‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 七、参考文献‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 4 四、操作步骤‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 产品描述 DNA 的氧化损伤是由于DNA 与活性氧 (ROS) 尤其是羟自由基之间的相互作用造成的。由超氧阴离子 和过氧化氢通过Fenton 反应产生的羟自由基在DNA 中产生多重修饰。羟自由基对脱氧核糖基团的氧化攻 击将导致DNA 释放自由碱基，产生链断裂、各种糖修饰以及单个无碱基位点 (AP 位点) 。事实上，AP 位 点是由ROS 产生的损伤的主要类型。醛反应性探针 (ARP ； -氨氧基甲基羰基肼-D-生物素) 特异性地与 AP 位点的开环上的醛基反应。通过这个反应可以检测到导致醛基形成的DNA 修饰。用过量ARP 试剂反应 后，DNA 上的所有AP 位点均用生物素做了标签。可以用亲和素-生物素法，用连接到亲和素上的过氧化物 酶或碱性磷酸酶做比色法检测来对这些带有生物素标签的AP 位点进行计数。DNA 损伤定量试剂盒包含用 5 于检测每1×10 个碱基对中1-40 个AP 位点的所有必需溶液。 本试剂盒仅适用于基因组DNA 中无碱基位点（abasic sites）的检测。 在无碱基位点处制备ARP 标签的机制： 试剂盒内容：5 samples ARP solution100 μl × 1管 DNA binding solution10 ml × 1瓶 ARP-DNA standard solution不同浓度各250 μl Substrate solution10 ml × 1瓶 Filtration tube5管 TE buffer15 ml × 1瓶 Washing buffer1包 HRP-streptavidin 25 μl × 1管 96孔板1块 20 samples ARP solution250 μl × 1管 DNA binding solution10 ml × 1瓶 ARP-DNA standard solution不同浓度各250 μl Substrate solution10 ml × 1瓶 Filtration tube20管 TE buffer40 ml × 1瓶 Washing buffer1包 HRP-streptavidin 25 μl × 1管 96孔板1块 储存条件 运输条件 0-5℃ 室温 所需设备 - 带有630-670 nm滤光片的酶标仪 -培养箱 -10 μl和200 μl的可调式移液器，多通道移液器 -微量离心机 操作步骤 ARP反应 (制备ARP标记的DNA) 1. 用TE buffer 溶解纯化后的DNA，测定吸光度(260nm)。按吸光度换算浓度(DNA 浓度:以50 μg/l 为吸光度1)、用TE buffer 调节浓度至100 μg/ml。 2. 在0.5 ml 管中混合10 μl 纯化的基因组DNA 溶液 (100 μg/ml) 和10 μl ARP 溶液，37℃下孵育1 小时。 3. 用100 μl TE 洗涤过滤管内侧。 a) 4. 向ARP 标记的DNA 溶液中加入380 μl TE buffer，并将此溶液加入过滤管中。 5. 以2,500-5,000 g 离心过滤管15 分钟，倒掉滤出液。 6. 向过滤管内加入400 μl TE buffer，用移液器将过滤膜上的DNA 重悬。 7