用MJ Opticon荧光PCR定量扩增检测系统快速排除太平鸟禽流感疑似病例.pdfVIP

试验研究 用MJ Opticon荧 PCR定量扩增检测 系统快速排除 平鸟禽流感疑似病例 依颖新，曾庆南，曹露丹 (辽宁省沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110031) 中图分类号 $854．43 文献标识码 B 文章编号 1 672—9692(2008)02—0006—02 2006年3月8日沈阳市动物疫病预防控制 匀。4℃、12000gmin离心15 min，小心倒去上清 中心受野生动物保护站的委托，诊断一起野生太 液，．倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4000dmin 平鸟突然大批死亡病例。当时野保站怀疑其为禽 离心10 S，小心倒去上清液，用微量加样器将其 流感疑似病例，我中心应用MJ Optieon荧光PCR 吸干，室温干燥3 min。加入11 Ixl DEPC水，轻 定量扩增检测系统在4 h内即完成了实验室诊 轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000dmin离心5 s， 断，通过试验迅速排除了这起禽流感疑似病例。 冰上保存备用，2 h内进行扩增。 1 发病情况 4．2．3 反应体系配置 按每个样品15 RT— 2006年3月，沈阳市内的中国医科大学天 PCR反应液，4个样品1颗RT—PCR反转录酶颗 井内有35只野生太平鸟，除有2~3只处于濒死 粒的比例配制反应液，然后向每个荧光RT—PCR 期外，其余全部突然死亡。 管中各分装15 ，再加入制备好的RNA溶液各 2 临床症状 10 l，盖紧管盖。 死亡的鸟仅口部吐出鲜血，无其他外观病 4．2．4 荧光RT—PCR检测 将PCR管放入荧光 变。 RT—PCR检测仪内。循环条件设置：第1阶段，反 3 剖检变化 转录42℃，30 min；第2阶段，预变性92 cI=， 肝破裂、出血，心肌出血，胃内容物为黑色 3 min；第3阶段，92℃、10 S，45℃、30 s， 块状，呈松油样，肌胃底出血，腺胃溃疡。 72℃、1 min，5个循环；第4阶段，92℃、10 S， 4 实验室诊断 60℃、30 S，40个循环，在第4阶段每个循环的 4．1 材料 分别采集2只太平鸟的心、肝、肺、 退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收 气管、脾、肾、泄殖腔作为病料。禽流感荧光 集的荧光曲线和Ct值判定结果。 PCR诊断试剂盒购自深圳市匹基生物工程股份有 5 结果 、 限公司。应用美国生产的MJ Optieon荧光PCR 经荧光PCR扩增检测，结果阳性对照的Ct 定量扩增检测。 值为17，出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值， 4．2 方法 无扩增曲线。样品扩增曲线无Ct值，无扩增曲 4．2．1 样本前处理 无菌采取死太平鸟的心、 线，表示样品中无禽流感病毒。 肝、肺、气管、脾、肾、泄殖腔等组织2．0 g， 6 讨论 加入10 IYll pH 7．4的磷酸盐缓冲溶液进行研磨， 目前禽流感、新城疫检测方法主要有3种： 4℃、3 000dmin离心15 min，取上清液转入15 ml 鸡胚病毒分离、血清学检测、分子生物学方法 灭菌的Eppendoff管中。 (核酸检测)，其中血清学诊断与核酸诊断目前成 4．2．2 核酸提取 每管加入600 裂解液，分 为禽流感、新城疫检测采用的常规方法。 别加入被检样本、阴阳对照各200 Ixl，再加入 6．1 鸡胚病毒分离法 传统采用的鸡胚病毒分 200 Ixl三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 S，于 离是国际兽疫局 (OIE)推荐的方法，具有准确、 4℃、12 000 r／rain离心15 min。另