红松查尔酮合酶基因和肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆及功能分析.docVIP

　　红松查尔酮合酶基因和肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆及功能分析 第 1 章 绪论 1.1选题的背景及目的意义 红松是松科松属的半阳性树种，是国家二级重点保护植物[1]。红松树龄长，耐寒，易受风倒，生殖缓慢，树高能达到 25 米以上[2]。红松作为红松阔叶林中的优势树种，主要分布在中国东北。此外，在日本、朝鲜、俄罗斯也有少量分布。吉林境内的红松主要分布在长白山，一般在海拔 600-1300 米之间[3]。长白山自然保护区的原始红松阔叶林有 4.07 万hm2[4]。据多年统计，我国长白山和小兴安岭地区每年的红松产量为 3 万吨左右[5]。红松树干粗壮，是天然的栋梁之材，其不易开裂弯曲、耐水、油漆性能良好且易干燥、加工性能良好的特点，使红松木材作为优良的工业建筑用材，广泛用于建筑、家具等诸多领域，同时红松还是吉林省的主要造林树种[6]。林木功能基因的研究已成为植物学领域的研究热点之一。RNA 干扰等分子生物学方法是林木功能基因研究的重要手段。杨树的基因组较小，基因组测序已完成，杨树已被作为模式林木树种应用于木材的形成、抗逆性遗传改良等方面的研究[7]。黄酮类化合物是植物自身产生的一类对其生长发育具有重要作用的酚类化合物[8]。它们在红松中分布广泛，在红松所有器官中都检测到黄酮类化合物的存在[9]。黄酮类化合物参与了包括呼吸作用、光合作用等在内的很多生理活动[10]。它们在植物抗紫外辐射，抗氧化，雄性不育和防御病原菌侵染中发挥重要作用[11]。黄酮类化合物还能为花、果实等器官提供色素，从而影响植物花色[12]。黄酮类化合物对人体也有很多益处。它们能抗癌[13]，抗肿瘤[14]，增强免疫力，抵抗辐射等。黄酮类化合物保健功能的开发已经受到重视[15]。查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黄酮类化合物合成途径中重要的聚酮合成酶[16]。截至目前，已有数百种植物的 CHS 基因被克隆出来，但松科植物关于 CHS 基因的研究却很少，仅有马尾松、海岸松、辐射松和北美乔松等 CHS 基因的完整 cDNA 序列被扩增出来。因此研究红松 CHS 基因能为其他松树 CHS 基因的研究提供参考，也有助于了解其在黄酮类化合物合成途径中的调控机制。本研究以红松作为材料，克隆了红松 CHS 基因，进行了生物信息学分析，并构建了原核表达载体。为运用基因工程手段改良红松品种，提高红松抗病抗逆性做了铺垫。 1.2黄酮类化合物的研究进展 黄酮类化合物是植物自身产生的一类对其生长发育具有重要作用的酚类化合物。黄烷核，即 C6- C3- C6 结构(图 1.1)构成了黄酮类化合物的基本骨架。由于连接的官能团、连接位置等不同，黄酮类化合物在以 2-苯基色原酮为母核的基础上分为二氢黄酮醇类(flavanonols)，异黄酮类(isoflavones)，黄酮类(flavones)，花青素类(anthocyanidins)，黄酮醇类(flavonols)，黄烷类(flavans)，黄烷酮类(flavanones)等[24]。黄酮类化合物的合成步骤已研究清楚[25]。丙二酸途径生成的丙二酰辅酶 A 和苯丙氨酸代谢途径生成的香豆酰辅酶 A 是黄酮类化合物的直接前体[26]。这两种前体在查尔酮合成酶和查尔酮异构酶的逐步催化下，生成黄烷酮。黄烷酮在不同酶的催化下，分成三个分支，最终分别生成异黄酮类、黄酮类、花青素等次级代谢产物[27](图 1.2)。第一个分支，黄酮合成酶以黄烷酮为底物，生成黄酮。迄今为止，仅在荷兰芹等少数植物中发现黄酮合成酶[28]。第二个分支生成了二氢黄酮醇。此过程是在黄酮烷-3-羟化酶作用下完成。二氢黄酮醇的降解分成两个途径，分别生成黄酮醇和花青素。第三个分支，异黄酮合成酶以黄烷酮为底物，生成异黄酮。黄酮类化合物在植物体内分布广泛，在所有器官中都检测到黄酮类化合物的存在。黄酮类化合物参与了包括呼吸作用、光合作用等在内的很多生理活动[29]。黄酮类化合物对人体有很多益处。它们能抗癌，抗肿瘤，抗辐射等。黄酮类化合物的保健功能的开发已经受到重视。 第 2 章 红松 CHS 与 CCR 基因的克隆与分析 2.1 引言 本章主要内容：用改进的CTAB法提取红松总RNA，将红松总RNA反转录形成cDNA。参照 GenBank 上已公布的红松近源物种的基因序列，分别设计引物。以红松 cDNA 为模板，分别克隆了 CHS 和 CCR 基因，并进一步纯化。CHS 和 CCR 基因分别与 pMD-18T 载体连接，构建重组质粒 pMD-18T-CHS 和 pMD-18T-CCR，并转化到 E. coli JM109 感受态细胞中。通过菌落 PCR 鉴定，筛选出阳性克隆菌进行测序，并对测序结果进行了生物信息学分析，为下一步的研究奠定基础。 2.2 实验材料与仪器