耐碱蛋白A的表达及相关蛋白的分离纯化研究.docVIP

　　耐碱蛋白A的表达及相关蛋白的分离纯化研究 1文献综述 1.1蛋白A 金黄色葡萄球菌蛋白A {Staphylococcus aureus protein A, SPA)是一种共价结合肽聚糖的胞壁结合蛋白，是一个具有延展形态的多肽,与人及多种哺乳动物血清中IgG的Fc片段具有特异型的相互作用。蛋白A能与多种类型免疫球蛋白结合，但结合能力不尽相同，结合率分别为/gG 95%，IgM51%, IgA 14%, IgE7%。如图1.1所示，蛋白A主要包括三个部分：信号肽序列（S)，五个高度同源的IgG结合结构域（E、D、A、B、C)以及错定蛋白结构域（X)。天然的蛋白A分子量大约为42 kDa,等电点为5.1,热稳定性较好，且分子中不含有二硫键。蛋白A的化学稳定性也比较好，其构象在较大的pH范围（0.99-11.8)都能保持稳定，甚至在6M盐酸胍盐溶液条件下大部分的蛋白A分子都能保持构象稳定由于蛋白A亲和介质与IgG的Fc部分特异性的相互作用，其在亲和层析体系有着广泛的应用[4，5]。SPA是最早被发现的免疫球蛋白结合分子之一，在过去的几十年里己经得到广泛的研究。由于SPA与免疫球蛋白的亲和性，SPA亲和吸附介质作为抗体检测和纯化的一种手段己经得到广泛的使用。最近，人们己经成功构建出一个最小化的SPA衍生物，通过改进SPA的一个结构域而提高其对工业纯化过程中恶劣条件的承受能力。在抗体纯化领域，70?80%的技术都是采用了蛋白A亲和层析的方法，广泛应用于实验室小规模和工业大规模抗体的制备当中[6，7]。为了不同的工业生产目的，人们己经开发出几种不同的蛋白A吸附剂，常见的几种蛋白A亲和介质如图1.2所示。 1.2蛋白A的基因工程改造 基因工程技术生产蛋白A主要包括：将设计好的编码重组蛋白A的目的基因片段与表达载体如质粒等拼接到一起，然后将表达载体转入宿主细胞形成基因工程菌，基因工程菌进行大规模培养、诱导表达后再经过一系列的分离纯化步骤即可以得到重组蛋白A。采用基因工程技术来生产重组蛋白A (rebinant protein A, rPA)可以解决金黄色葡萄球菌对天然蛋白A的表达量太低，且金黄色葡萄球菌为致病菌等问题，这也满足了蛋白A大规模、安全可行生产的需求。利用基因工程技术生产重组蛋白A,还可以在基因水平上定向地改造蛋白A,制备性质更优的SPA衍生物。Ljungquist等[23]通过在蛋白A的C端增加一个半耽氨酸，可实现蛋白A的定点固载，从而提高了蛋白A亲和介质的载量。Hellebust等[24]将蛋白A的C端与蛋白G或(5-葡萄糖酸酸酶进行了融合，发现融合蛋白对IgG的结合活性并没有受到影响，并且C端对蛋白酶的耐受性也有所提高。金黄色葡萄球菌蛋白A具有与免疫球蛋白特异性结合的能力，其作为用于纯化单克隆抗体（Mabs)的一种亲和配基而得到广泛的应用。由于蛋白A亲和层析在工业生产治疗性单克隆抗体方面较高的纯化效率，其己经成为从细胞上清液中获得Mabs的必经步骤。然而，较低的洗脱pH以及对碱性条件的敏感性限制了其在工业生产抗体纯化方面的大规模应用。另外蛋白A也广泛用于免疫吸附治疗等领域，但是由于蛋白A对人IgG3结合能力较弱而导致蛋白A免疫吸附剂对某些疾病的治疗效果不佳。因此，需要对蛋白A进行改造以改善其相应的亲和吸附剂对碱性条件的耐受性、洗脱pH或者对人IgG的吸附范围，等等。 2耐碱蛋白A载体的构建与表达 2.1引言 蛋白A是一种用于纯化单克隆抗体（Mabs)的亲和配基。由于蛋白A亲和层析较高的纯化效率，其已经成为工业生产治疗性单克隆抗体的必经步骤。蛋白A层析介质价格昂贵，基于重复使用的需要，需在抗体纯化过程中插入在位清洗（OP)步骤以去除杂蛋白、脂质、核酸、微生物等污染物。NaOH目前是CIP步骤最有效的清洁剂，可以高效地去除紧密结合的杂质以及使微生物失活。因此，使用能够耐受高pH的基质更加有优势。国内外已经开展了很多关于耐碱蛋白A的研究，例如GE研发出的MabSelect SuRe蛋白A亲和介质能够耐受高达0.5 M的NaOH溶液等等。目前，国内关于耐碱蛋白A的研究方面较为薄弱，亟需建立耐碱蛋白A的国产化技术体系。在各种蛋白质配基当中，蛋白A相对比较耐碱性条件但是不能抵抗高碱性条件(gt;0.1.MNaOH)。因此，需要使用蛋白质工程方法来研究如何提升它的IgG-Fc绑定区域的抗碱稳定性。蛋白A含有五个高度同源的IgG结合结构域（E，D，A. B和C)，其中由于B结构域化学稳定性较好，常对其进行碱基修改来构建出稳定性更好的蛋白A类似物。Z结构域是一种B结构域的基因工程衍生物，也是最常使用的人造蛋白A，它比天然的B结构域有更高的化学稳定性。基于以上想法以及参考GE的经验，本论文选择了对B结构域进行适当的碱基修改，对获得的新的B结构