绒毛白蜡表达谱分析与MYB基因的克隆和功能研究.docVIP

　　绒毛白蜡表达谱分析与MYB基因的克隆和功能研究 第一部分 文献综述 1 新一代测序技术 转录组是指某一生理条件下细胞所能转录出来的全部RNA。转录是基因表达调控的关键环节，决定着细胞的时空表达特异性。通过快速、准确的高通量测序技术人们可获取特定条件下某一生物体的基因表达信息，推断基因的功能，并可揭示某些特定基因的调控作用机制。因此已成为生物科学领域用来研究基因功能及其表型的重要手段之一。目前使用的高通量测序技术主要包括：1）罗氏454测序技术，其主要依赖于焦磷酸测序法技术平台；2）Illumina公司开创的Solexa测序技术，该测序平台所需的文库构建方法简单，可通过任意能产生数百碱基长度、两翼连有接头的片段进行构建；3）ABI公司的SOLid测序技术，该测序平台引入DNA连接酶驱动反应，基于边合成边测序的原理[1]。上述高通量测序技术是对传统测序的深刻变革，其不同于传统的基因芯片和基因表达序列分析SAGE（serial analysis of gene expression，SAGE）技术，省去了构建传统文库的复杂过程，采用边合成边测序策略，一次实现对大量序列的测定，极大地提高了测序效率，同时可得到准确度和覆盖度极高的转录本信息[2]。 .. 1.2 新一代测序技术在植物研究中的应用 近年来，伴随着高通量测序技术的发展，许多模式植物和非模式植物的转录组分析正在不断展开，极大的推动了植物分子生物学领域的发展。目前转录组测序主要用于以下几方面的研究：如发掘新基因和构建物种基因文库、发现植物中有用的SNP位点以及进行分子标记筛选、用于转录图谱的绘制、确定代谢途径，此外，该技术在分子进化、sRNA的发现和功能验证、功能基因筛选和植物性状改良方面均具有广泛的应用前景[1]。在模式植物方面，例如，综合比较盐敏感物种拟南芥和水稻的转录组，以及耐盐品种如香雪球（十字花科）和紫羊茅（禾本科）的转录组数据，结果表明不同植物在耐盐性表达调控方面存在较大差异[3-4]。在此基础上，人们根据盐生植物香雪球和紫羊茅的基因表达模式对敏感型植物拟南芥和水稻的调控信号元件进行相应的基因改造，从而成功增强了上述模式植物的抗逆性。在非模式植物方面，转录组测序研究也日趋广泛。Sara等[5]对葡萄果实发育过程进行了转录组测序，检测到果实特定发育阶段的17324个基因，通过与以往基因芯片研究结果进行比较，发现了谷胱甘肽转移酶（GST）家族的53个新基因，此外还发现了28个新的MYB转录因子成员及大量的SNP位点和可变剪接位点。有关利用转录组测序发现新的分子标记方面也有很多报道，如对紫花苜蓿708和773两种基因型茎的转录组研究，发现了其中的1294个SSRs、10,826个SNPs，其中74%为单一SNP，3%包含多个SNP[6]。在利用转录组测序技术发现差异表达基因以及明确代谢途径方面，Yang等[7]对棉花体细胞胚（SE）发育阶段的转录组进行了测序，从中发现了5076个差异表达基因，并结合棉花基因组测序表达框等手段，确定了棉花体细胞胚分化与脱分化调控过程中的生长素复合体信号代谢途径，这一结果为研究植物胚胎发育机制提供了重要的基础资料。此外，Li等[8]研究了棉花早期纤维的发育特点，通过对棉花纤维起始期0 d（DPA）和3 d（DPA）和伸长期（10 DPA）的转录组测序，从中发现了1931个差异表达基因，其中1536条基因的表达量上调，394条基因表达下调。 .. 第一章绒毛白蜡基因表达谱测序与分析 1.1试验材料 选取饱满度一致的绒毛白蜡种子，将其播种于V（泥炭土）：V（蛭石）=2：1的混合基质中，于光照时间12 h/d，相对湿度约60%的温室中培养。待种子萌发生长1个月后，用200 mM的NaCl溶液浇灌，分别在胁迫处理0 h、0.5 h和24 h后，取绒毛白蜡幼苗立即投入液氮中保存。所用绒毛白蜡种子采自东营林场，由山东省林业科学研究院提供。高通量测序技术在当今科研工作中得到广泛应用，该技术在发现新基因、相关代谢途径、SNP 以及各种分子标记等基因资源等方面具有极大的优势。因此，通过高通量测序对非模式植物、农作物和经济作物构建相应的转录组和表达谱数据库已成为分子生物学研究的重要手段。本研究使用 Illumina 测序平台对不同时间段 NaCl 处理下的绒毛白蜡幼苗进行表达谱分析，对差异表达基因进行 GO 功能显著性富集分析和 PathRNA 为模板，采用六碱基随机引物反转录得到 cDNA 第一链；加入 dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 以及 Buffer 缓冲液进行 cDNA 第二链的合成； 文库制备主要包括：a）采用 QiaQuick PCR 试剂盒纯化上述处理好的样品 cDNA，b）EB 缓冲液洗脱，c）对洗脱后得到的