脆皮蛙Cathelicidins基因克隆、表达与构成与功能分析.docVIP

　　脆皮蛙Cathelicidins基因克隆、表达与构成与功能分析 1文献综述 1.1两栖类抗菌肽研究 两栖类动物是一类能够同时适应陆地和水生生活的物种，其裸露的皮肤具有无毛、无羽、无鳞片的独特特。它们复杂多变的生存环境赋予两栖动物皮肤多种功能，不仅具有呼吸、排泄、繁殖、调节体温，保持水分平等功能⑴，而且还具有防御和抵抗生存环境中的各种各样的病原微生物和肉食动物的袭击等功能。为了适应变化多样的生存环境，两栖动物在进化过程中已经成功形成了三套防御机制：（1)物理屏障：在外界刺激或是病菌感染作用下，其粘液腺向体表分泌大量生物活性物质，主要是糖蛋白和蛋白聚糖形成的多肽网，附着于皮肤外表面，阻止外界病原微生物的侵入和破坏；（2)获得性免疫防御系统：主要成份是大量的IgG抗体；（3)先天免疫系统：其主要成分是小分子抗菌肽。1970年，首次从两栖动物中分离发现了一种抗菌肽一Bombesin[4]，它是从欧洲蟾餘皮肤分泌液中分离得到的，该肽由24个氨基酸残基组成，具有溶血活性等生物学活性,这一发现使生物学家对两栖动物中分离抗菌肽产生了极大的兴趣，同时这也为两栖动物中抗菌肽的幵发和研究奠定了一定的基础。上世纪80年代，从非洲爪擔QXmopiis Laevis、皮肤分泌液中发现了具有更多生物学功能的抗菌肽多肽一Magainins。该类抗菌肽通常由21-27个氨基酸残基组成，它们不仅对绝大多数菌体具有杀伤作用，而且对原生动物的生长也具有抑制作用。另外该类抗菌肽对正常动物细胞没有破坏作用，但对癌细胞却表现出一定的杀伤作用，且具有较低的病原菌耐药性这一发现进一步促进了对两栖类抗菌肽的研究和开发。 1.2 Cathelicidins 的研究进展 Cathelicidins是脊椎动物自然免疫的关键因子，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁，迄今为止，在自然界几乎所有脊椎动物，包括哺乳类、鸟类，爬行类和低等的鱼类中均有发现。由于其中间部位的保守结构域与猪中性粒细胞中纯化出来的cathelin具有较高的序列相似性，因此在1995年将其命名为cathelicidinlis)。在20世纪90年代，首次从猪骨髓中发现了 cahtelicidinsli9、研究发现cathelicidins不仅具有广谱的抗微生物活性，而且还具有多种许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具冇趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨哩细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞调亡和淋巴细胞活化等因此在新药幵发中，cathelicidins具有广阔的应用前景。 2脆皮大头娃皮肤cathlicidins基因的克隆及序列分析 2.1引言 Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域组成的宿主防御肽家族，是脊椎动物自然免疫的关键因子，发挥重要的抗微生物感染和病原体入侵的效应，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。与传统抗生素相比较，这类抗菌肽分子在医疗、制药和农牧业领域具有更广泛的应用前景和更巨大的潜力。迄今为止，已从自然界几乎所有动物体中分离克隆获得了多种cahtelicidins,如人的LL-37、牛的BMAPs和Bacs、猪的PMAPs、马的e-CATHs、鸡的foporin 禾fl japonicin 等家族抗菌肽，但是到目前为止对两栖类娃科物种体中cahtelicidins的报道还几乎没有。因此，对两栖类蛙科动物体中cathelicidins的发现与研究，不仅填补了脊椎动物cathelicidins进化的空1?，同时也为蛙科动物天然免疫防御机制的了解开辟了新思路。脆皮大头蛙(Limnonecte:sfragilis)又名脆皮娃，无尾目（zi/nonectes)，属我国特有物种，广泛分布于中国海南省的三亚、五指山、昌江和尖峰岭等地，主要生活于海拔300?900m的山区平缓多石浅水沟内。因蛙体较小、皮肤光滑且薄、骨傲脆嫩易发生骨折皮破，而得名脆皮蛙。在本章中，我们采用分子克隆技术，从脆皮大头蛙皮肤组织中提取总RNA，构建皮肤cDNA文库，然后经半巢式PCR法克隆蹄选出了编码cathelicidins前体的cDNA核酸序列，并对其序列进行了分析、预测以及构建系统进化树，从而对cathdicidin雄因家族的进化关系进行了研究；根据cathdin区域中弹性蛋白酶（哺乳动物catheliddin家族常见酶切位点，-V-)对前体肽中成熟肽的序列进行了预测，采用化学合成法合成所预测的成熟肽序列，并对其所具有的抗微生物进行初步研究。 2. 2实验材料 2.2.1动物、菌株和质粒 AxyPrepTM Multisource Total RNA Miprep Kit 购自美国 Invitrogen 公司；cDNA 文库构建试剂盒 Cre