总氮量的测定-微量凯氏定氮法.docVIP

实验四 微量凯氏定氮法 实验类型：综合 项目学时：5 目的 1. 掌握微量凯氏定氮法测定样品总氮量和蛋白质的原理和方法 2. 学会使用凯氏定氮仪 原理 凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量。 天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被分别氧化成CO2和H2O，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，是为“消化”。 该反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾/硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂促进反应的进行。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下： NH2 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)计算出待测物中的氮量。 滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH 5.2~5.6，将NH4H2BO3的蓝/绿色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。 本法适用范围0.2~1.0 mg氮，相对误差应小于2 %。 0.9 %NaCl溶液 4. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末 5. 2 %硼酸 6. 混合指示剂(田氏)：0.1 %甲烯蓝乙醇溶液50 ml与0.1 %甲基红乙醇溶液200 ml混合配成(贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏) 7. 0.0500 M HCl 8. 硼酸-指示剂混合液： 2 %硼酸溶液100 ml，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可(约加1 ml左右混合指示剂)。 9. 标准硫酸铵溶液(0.3 mg N/ml) 10. 卵清蛋白等含蛋白质样品 器具 凯氏烧瓶 消化架 吸量管(1 ml, 2 ml) 量筒(10 ml) 凯氏定氮蒸馏装置 容量瓶(50 ml) 微量滴定管(3 ml, 5 ml, 可读至0.02 ml) 锥形瓶(50~100 ml) 操作步骤 ㈠ 样品的处理 血清样品：取人血(或猪血)放于离心管中，于冰箱中放置过夜，次日离心除去凝血块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清1.0 ml加入0.9 %NaCl 4.0 ml，仔细混匀备用。 固体样品：在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，置105 ℃ (非游离的水不能在100 ℃以下烘干)烘箱内干燥4 h至恒重。 ㈡ 消化 取2个50 ml凯氏烧瓶，向1号烧瓶内加2 ml稀释血清溶液或0.1 g干燥样品(直接加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上)，向2号烧瓶加入2 ml水作空白对照。 在每个烧瓶内加入硫酸钾-硫酸铜混合物约0.2 g，浓硫酸3 ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。 在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。 消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10 ml (注意慢加，边加边摇)。冷却后将瓶内容物转入50 ml容量瓶，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 ㈢ 蒸馏 1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。使用方法如下： 开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出(水不宜开得过大以免水从G管溢出)。开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10ml入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用(可用pH试纸检查)。 A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时依次在B室加入消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，经M管进入锥形瓶由硼酸吸收。 图1-1 凯氏微量定氮蒸馏装置 2、蒸馏标准样品 先用标准硫酸铵溶液试验2~3次。蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部即可。 取3个50 ml锥形瓶，各准确加入10 ml硼酸(加指示剂1~2滴，溶液呈淡紫色或灰色)，用表面皿复盖备用。 加样：用移液管吸取1 ml标准硫酸铵溶液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1 ml清洗漏斗。取一个盛有硼酸+混合指示剂的锥形瓶，置于