脂肪酶活检测原理及方法.docVIP

脂肪酶活检测原理及实际方法： 一、原理以及标准曲线做法 1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种 底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。 2.所需试剂有：CAS 碳链长度 出货号 价格 名称 830-03-5????C2????N8130-1G ￥462????2635-54-9 C4?? N9876-1G??￥5701956-10-1??? C8????21742-1G-F ￥4871956-11-2 C12??? 61716-1G ￥4351492-30-4??? C16 N2752-1G ￥37914617-86-8???C18??? N3627-1G??￥2621.97 全部为色谱纯试剂，购于sigma公司 标准曲线绘制： a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L): 称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b.标准曲线绘制： 分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。 方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。 上表是方法一测得标准曲线 脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。 公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反应系数，R2是相关系数。则，酶活计算公式为： 酶活=1000*n*V*(y-0.0272) / 14.474t 其中n为稀释倍数，t为反应时间（单位：min），V为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到μmol的比例。 底物耐碱性测定及试验液配制 底物耐碱性测定 a.6种底物分别加至pH7，pH8的37℃的PBS缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照； b.6种底物分别加至pH8，pH9的Tris-HCl缓冲液中（37℃），每隔5min检测一次颜色变化，拍照； c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。 测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法 方法一：（96孔板法，粗略，速度快） 溶液的配制 溶液A：溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇（浓度为8.89*10-3M，或8.89mM），4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定； 溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。 96孔板（220μL）： A液（底物液） ：18μL ↗ 体系液180（μL） + 酶液（40μL） ↘ B液（pH缓冲液）：162μL 此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889mM。 方法二：（吸光度法，精准，速度慢） a.溶液的配制 溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定； 溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。 b.脂肪