灰飞虱鞘氨醇激酶时空表达分析及其对杀虫剂胁迫的响应 - 中国农业科学.pdf

中国农业科学 2016,49(22):4387-4397 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.22.011 灰飞虱鞘氨醇激酶时空表达分析及其对杀虫剂胁迫的响应 1 1 1 1 1 2 1 焦文娟 ，李飞强 ，张敏菁 ，史肖肖 ，朱木菲 ，毛存贵 ，祝增荣 1 2 （浙江大学昆虫科学研究所/水稻生物学国家重点实验室/农业部农业昆虫学重点实验室，中国杭州 310058 ；Department of Medicine ，Stony Brook University ，Stony Brook，NY ，USA ） 摘要：【目的】明确灰飞虱（ Laodelphax striatellus Fallén）鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SK）的 分子特征，研究SK在携带水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）与健康灰飞虱两个种群的时空表达及其对杀 虫剂胁迫的响应。【方法】利用 PCR 技术克隆灰飞虱 SK（ LsSK ）基因序列；使用荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术分 析 LsSK 在带毒种群与健康种群灰飞虱 1—5 龄若虫及成虫期的表达差异，并检测该基因在雌雄虫头、唾液腺、中 肠、马氏管、卵巢和精巢等组织中相对表达量；采用手动微量点滴仪将3种杀虫剂（吡虫啉、噻嗪酮和溴氰菊酯） 点滴于灰飞虱 4 龄若虫中胸背板，确定 3 种杀虫剂的半致死浓度（LC50 ）；根据半致死浓度的 3 种杀虫剂处理试虫 后检测 LsSK 的表达动态；采用注射双链RNA（dsRNA）的方法沉默带毒种群和健康种群4龄若虫体内 LsSK 后，用 半致死浓度的3种杀虫剂处理试虫并分析死亡率。【结果】克隆得到一段长度为1 282 bp的 LsSK 基因片段（GenBank 登录号：KT989975）。氨基酸系统进化树显示LsSK与其他半翅目昆虫SK 聚在同一支。LsSK氨基酸序列包含SK 酶 的4个保守区域C1—C4，其中SK激酶的活性位点——DAG活性区域位于C1—C3区域。qRT-PCR结果显示 LsSK 在 带毒种群4龄若虫中表达量最高，3龄次之；健康种群5 龄若虫表达量最高，1、4龄次之。且 LsSK 在带毒种群3、 4龄表达量显著高于健康种群同时期若虫（P ＜0.05）；带毒成虫 LsSK 表达量显著高于健康成虫（P ＜0.05）。LsSK 在带毒雄成虫各个组织中的表达量均显著高于同种群雌成虫和健康雌雄成虫的各相应组织，且在唾液腺和马氏管 的表达量最高，头部次之。用半致死浓度的 3 种杀虫剂（吡虫啉 LC -1 -1 50 为 6.5 ng·μL ，噻嗪酮为 500 ng·μL ，溴氰 菊酯为 37.5 ng·μL-1 ）处理带毒和健康种群的 4 龄若虫后，试虫LsSK 含量变化与响应速度均不同。噻嗪酮处理后 LsSK 水平升高且响应最为迅速，溴氰菊酯处理后 LsSK 表达水平无变化（P ＞0.05）。用 3 种杀虫剂处理带毒和健 康试虫，其死亡率分析结果表明，两种群注射dsSK组 3种杀虫剂处理后死亡率均显著高于两种群注射dsGFP组和 不注射组。【结论】克隆了LsSK 基因片段且其在带毒灰飞虱4龄若虫中表达量最高。沉默 LsSK 后，带毒和健康种 群灰飞虱在杀虫剂处理后的死亡率均显著上升，表明SK 基因有利于灰飞