h3n2 型猪流感病毒m2 蛋白表达分析.pdf

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, January 25; 26(1): 16−21 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn ©2010 CJB, All rights reserved. 动物及兽医生物技术 H3N2 型猪流感病毒M2 蛋白表达分析 王晓杜，陈培君，沈阳，邱亚峰，邓绪芳，史子学，彭丽娜，罗金燕，刘超，马志永 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241 摘 要: 流感病毒的M2 蛋白在流感病毒复制中起着重要作用，是抗流感病毒的靶标分子。本研究以提取的病毒基因组 RNA 作为模板，RT-PCR 扩增H3N2 亚型猪流感病毒M2 基因，分别构建了重组原核表达载体和重组真核表达载体，建 立了M2 蛋白的原核和真核表达系统。通过大肠杆菌表达系统，制备了M2 重组蛋白，并免疫大鼠制备了多克隆抗体。 Western blotting 和间接免疫荧光方法检测表明所制备的抗体能识别真核表达的 M2 蛋白和病毒感染细胞后表达 M2 蛋 白，具有良好的特异性。重组M2 真核表达载体转染Vero 细胞，表达的重组M2 蛋白大小为20 kDa ，定位于细胞浆中， 与病毒感染细胞中的M2 蛋白定位相同。Western blotting 检测表明M2 蛋白在病毒感染细胞 12 h 后才能检出，晚于NS1 、 NP 和 M1 ，属于病毒复制的晚期蛋白，可作为病毒复制晚期的指示分子。本研究为弄清M2 蛋白在病毒复制过程中的 生物学功能奠定了基础。 关键词: H3N2 ，猪流感病毒，M2 蛋白，多克隆抗体 Characterization of M2 gene of H3N2 subtype swine influenza virus Xiaodu Wang, Peijun Chen, Yang Shen, Yafeng Qiu, Xufang Deng, Zixue Shi, Lina Peng, Jinyan Luo, Chao Liu, and Zhiyong Ma Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Shanghai 200241, China Abstract: M2 protein of influenza A virus is encoded by a spliced mRNA derived from RNA segment 7 and plays an important role in influenza virus replication. It is also a target molecule of anti-virus drugs. We extracted the viral genome RNAs from MDCK cells infected with swine influenza A virus (SIV) H3N2 subtype and amplified the SIV M2 gene by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using the isloated viral genome RNAs as template. The amplified cDNA was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a(+) (designated pET-28a(+)-M2) and a eukaryotic expression vector p3xFLAG-CMV-7.1 (designated p3xFLAG-CMV-7.1-M2), respectively. The resulted constructs were confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analy