血清饥饿法诱导人角质细胞HaCaT细胞周期同步化的研究.pdfVIP

第29卷 第2期 西华师范大学学报 (自然科 学版 ) 2008年6月 Vo1．29 No．2 Journal of China West Normal University(Natural Sciences) Jun．2008 文章编号：1673-5072(2008)02-0127-05 血清饥饿法诱导人角质细胞HaCaT细胞周期 同步化的研究 伍春莲 ，王宏斌 ，马红玲 ，王金发 (1．中山大学生命科学学院，广东广州 510275； 2．西华师范大学生命科学学院，四J1I南充 637002) 摘 要：探讨血清饥饿法对人表皮细胞HaCaT细胞周期的影响．采用无血清和低血清浓度的DMEM培养基饥饿 HaCaT细胞，分别培养6h，12h，22h时，用倒置显微镜观察细胞形态，并且收集各组细胞，用流式细胞仪分析细胞周 期各个时相细胞百分比．结果发现HaCaT细胞系在含0．2％FBS的DMEM培养基中培养 12h，细胞仍然贴壁生长， 并且可以使G。／G。期细胞百分率达到66．5％．因此，血清饥饿法可以应用于人表皮细胞 HaCaT同步于G。／G。期，从 而为后期药物筛选打下基础． 关键词：血清饥饿法；HaCaT细胞；细胞周期同步化 中图分类号：Q2—33 文献标识码 体外培养细胞同步化方法有多种，但其基本原理都是使细胞停止在细胞周期的某一时相．目前许多研究 工作报道了多种哺乳动物细胞和人体细胞的同步化方法¨ ，各实验室根据各自的条件，先后建立了温度 休克、短时间饥饿、照射、胰酶消化、药物抑制、机械振动收集分裂细胞等方法，有时是几种方法的结合使用， 均可收到良好的同步化效果．其中，血清饥饿法因为具有对细胞本身的干扰极小，并可于短期内获得大量 G。／G。期细胞等优点，而倍受重视．但用血清饥饿法对不同细胞系进行同步化处理时，所得的效果千差 万 别 ，因此不同的细胞所选用的血清饥饿的时间和血清的浓度是不同的．血清控制细胞周期的有效性和长 期饥饿对细胞的影响需要更进一步的阐述．血清饥饿法在核移植研究中已经得到广泛应用。。 ，而在药物筛 选、疾病治疗方面 叫的研究还不是很多，这两方面的研究都需要获得大量的G。／G。期，以便进行下一步实 验．已经证明，流式细胞仪技术对分析肿瘤细胞和正常细胞的细胞周期是一种有效的工具 川，它可以根据 不同细胞周期内DNA含量的不同而对细胞进行分析．另外，用PI和FITC进行双染可以达到区分G。和G。 期细胞的目的．因此，本研究将主要运用倒置显微镜和流式细胞术，从形态和细胞周期两方面，快速准确地摸 清人表皮细胞HaCaT血清饥饿培养的条件，并对这一方法作一个探讨，为下一步药物筛选打下基础． 1 材料与方法 1．1 实验材料和试剂 人体正常表皮细胞HaCaT，人体乳腺癌细胞MCF一7(均购自中山大学基础医学院)；胎牛血清(FBS，杭 州四季青公司)；碘化丙啶(PI)，胰酶(sigma)；无水乙醇；DMEM，青链霉素(Gibco，USA)． 1．2 实验方法 1．2．1 细胞培养 HaCaT(人表皮纤维化细胞)和MCF一7(人乳腺癌细胞)两种细胞都用DMEM培养基培养，添加10％胎 牛血清(FBS)和1％的青链霉素，置37~C，5％CO：培养箱中培养． 收稿日期：2008—02一lO 基金项目：广东省工业攻关项目(2004 作者简介：伍春莲(1976一)，女，四川彭州人，西华师范大学生命科学学院讲师，博士，主要从事细胞和分子生物学的研 究． 通讯作者：王金发(1947一)、男，中山大学生命科学学院教授，博导，主要从事分子遗传学的研究工作． 128 西华师范大学学报(自然科学版) 2008年 1．2．2 细胞同步化处理 将细胞以5 X 10 个／孔的密度接种于6孔培养板上，用含10％FBS的DMEM完全培养基培养至汇合率 达70％一80％，此时细胞处于对数生长期；用PBS冲洗细胞表面3次，去除残留于细胞表面的血清成分．各 组分别加无血清DMEM培养基、含0．2％FBS的DMEM培养基、含0．5％ FBS的DMEM培养基和含1％ FBS的DMEM培养基进行培养，并于