基因工程概念及基本步骤.pptVIP

5 DNA序列检测 ACTGAAGGCT 6. 限制性酶切图谱法 限制性酶切图谱法：在外源DNA分子的大小以及限制性酶切图谱已经知道的条件下，对重组分子进行酶切坚定，不仅能区分重组分子与非重组分子，有时还能初步确定期望重组子和非期望重组子。 简单来说，已经经过抗药性选择后的转化子经过少量提取质粒DNA，再草用适当的限制性内切酶消化之，然后根据电泳图谱分析质粒分子的大小，分子量大于载体的为重组分子；最终用载体上的已知酶切位点建立重组质粒插入片段的酶切图谱，并与已知数据进行击毙叫，进而确定期望重组子。该方法主要包括：全酶切法；部分酶切法。 bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 2. Partial digestion 10 kb insert Complete digestion 1 kb 2 kb 3 kb 4 kb X EtBr Stained agarose gel: Can not delineate the EcoRI sites 外源基因在宿主细胞中的表达 重组子 目的基因的mRNA 表达蛋白质 大肠杆菌（ E.coli）受体细胞 表 目的基因表达产物的检测 1）蛋白质的PAGE 对照 样品 Marker 2）表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达 目的基因的检测和表达（二） 　　例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。 目的蛋白的分离纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白 质粒 噬菌体 病毒 有切口的载体 基因载体 目的基因 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方 目的基因的表达 目的基因 基因载体 重组体 目的基因的分离和克隆 载体 工具酶 不同的表达系统 * * * * 2 载体DNA的选择 功能： 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。 目的基因 整合在宿主细胞染色体DNA中 独立于宿主细胞染色体DNA外 （独立的复制子功能） 基因载体 质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 …… 种类： 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pBR322质粒 质粒 宿主细胞 ori 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 限制性内切酶酶切 切 酶切 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 重组体的转化 转 含氨苄平板 重组质粒 感受态 重组分子的转化 转化过程： 感受态的形成：G+形成感受态时，细胞表面发