多萤光染色实验设计介绍 - cgmhorgtw.DOC

共軛焦顯微鏡--多螢光染色實驗設計介紹 進行多螢光染色之前，我們必需先知道儀器配備，才能知道適用那些螢光染劑，再來選擇合適的螢光組合以盡量避免訊號干擾，並以染色對照組判讀訊號的正確性，需考量的細節分述如下。 確認儀器激發光源與收光範圍 貴儀核心實驗室的共軛焦顯微鏡配 雷射種類 輸出功率 常見可應用螢光 405nm Diode laser 50mW DAPI、Hochest Argon blue laser (458nm、476nm、488nm、514nm) 65mW GFP、FITC、AlexaFlour 488 DPSS 561nm laser 20mW TRITC、PEAlexaFlour 546 HeNe 594nm laser 2mW Texas Red、AlexaFlour 594 HeNe 633nm laser 10mW Cy5、AlexaFlour 633、AlexaFlour 647 螢光染劑的選擇原則 亮度越高的優先選擇 選擇螢光染劑時我們可以上廠商的網站查詢相關資料，螢光的度有些是直接顯示該螢光的以ThermoFisher同綠色螢光FITC和Alexa Flour 488為例，FITC相對亮度是3，Alexa Flour 488是4，在選擇時就優先考慮Alexa Flour 488 螢光強弱分配 螢光分配的原則建議將弱螢光搭配強表現分子，強螢光搭配弱表現分子設備的影響，由於本儀器配備的594nm雷射功率相較其他波長雷射較弱(2mW)，一般建議以594nm激 螢光之間的干擾越小越好 透過廠商的線上工具協助決定多螢光染色的組合，以BD Fluorescence Spectrum Viewer(/us/s/spectrumviewer)為例，選擇想要搭配的螢光和激發的雷射波長，軟體便會自動顯示螢光的激發光譜(虛線)與散射光譜(實線)。以AF488+PE和AF488+AF568兩種搭配的比較為例來說明，AF488+PE的組合以488nm雷射激發綠色螢光AF488時，由於PE也同時被激發，我們只能壓縮AF488的收光範圍收AF488訊號收到來自PE的訊號干擾AF488+AF568的組合就沒有干擾現象，所以在選擇多螢光染色的搭配時，以此例來說，AF488+AF568優於AF488+PE。 遠紅螢光染劑 當多螢光染色達到四色以上時，常常會用到以633nm雷射， 染色對照組 Unstain 協助我們評估檢體的自體螢光，特別是蠟塊組織切片和一些自體螢光較強的組織，如腦、腎臟、肌肉等。 single stain 協助我們評估螢光間的干擾，以設定最佳拍攝參數。 secondary antibody only 適用於間接免疫螢光染色，協助我們評估二級螢光抗體的非特異訊號。 Isotype control 協助我們評估初級螢光抗體的特異性。