4、目的基因与载体的连接.ppt

提高产量 优质 抗病虫害 抗寒、旱、涝、盐碱 抗除草剂 抗凝血酶 克隆猪，器官移植 克隆猴，研究疾病的模型 远不仅如此 胚胎干细胞遇到伦理其它问题时 这个就没有问题了吗？ 改造环境 拯救濒危动物 基因工程（genetic engineering ） 将外源性遗传物质 通过载体 转入宿主细胞内， 经筛选，使其获得新的性状的过程。 基本原理（过程） 分：目的基因的获取 切：载体和目的基因的酶切 接：目的基因和载体的连接，重组子 转：重组子转入宿主细胞 筛：含有目的基因的重组子的宿主细胞的筛选 表达：目的基因在宿主细胞内的表达 主 要 内 容 基因工程的发展史简介 基因工程的基本原理 基因工程的应用 基因工程发展简史 基因工程发展简史 基因工程发展简史 ?第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标志着基因工程技术的诞生。  体外不同来源重组子 ◆1973年，S.N.Cohen等在美国PNAS上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Boyer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973） 的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。 基因工程发展简史 基因工程发展简史 基因工程发展简史 基因工程的流程(原理) 1、确定研究的目标 2、选择、构建合适的载体 3、分离目的基因 4、目的基因和载体的重组 5、重组子转入宿主细胞 6、重组子的筛选 7、目的基因表达 1. 确定研究的目标 纯的蛋白质 不需纯化蛋白 2. 选择、构建合适的载体 研究目的决定 载体选择后，对基因克隆方法具有一定的指导作用。 2. 选择、构建合适的载体 （1）载体的分类 2. 选择、构建合适的载体 独立于染色体外的能够进行自我复制的共价、闭环、双链的DNA分子 质粒的基本条件 分子量要小 复制起始点 多个克隆位点 筛选标志 容量要大 15K左右 原核表达载体---Pharmacia Tac Promoter GST-融合蛋白 GST标签 原核表达载体---Promega T7启动子控制 体外转录 SP6 T3 原核表达载体---Merck T7启动子控制 TrxA标签 His标签 原核表达载体—选择注意事项 启动子 T7，LacZ, Tac等 标签（Tag）的选择 GST TrxA His Tag SD序列问题 真 核 载 体 原核载体的条件 仍需其它条件 真核细胞复制起始点 polyA位点 真核的抗性 真 核 载 体---invitrogen 真 核 载 体---clontech 真 核 载 体---选择注意事项 启动子 SV40，CMV，等 Koza序列 -3，+4法则,GCCACCATGG 有无真核筛选标志 Neo(G418)、Hyr(潮霉素) EGFP、RFP、YFP 载 体 构 建 启动子强度 CAG启动子 C：巨细胞病毒增强子， A：鸡?-actin启动子， 鸡?actin外显子1， 鸡?-actin内含子1， G：兔globin内含子2， 兔globin外显子3 载 体 构 建 表达可控性 加入药物后、或停药后表达 载 体 构 建 载 体 构 建 一条mRNA分子双基因表达 载 体 构 建 Clontech pIRES2 特定位点切除载体 Phage display technology 植物载体 植 物 载 体 3、目的基因获取 1、从文库中筛选 （2）利用PCR技术扩增 4、目的基因与载体的连接 连接的方法 4、目的基因与载体的连接 连接的方法 （1）采用连接酶的方法 （2）利用