质纳米磁式分离外泌体技术.pptxVIP

 Rapid magnetic isolation of extracellular vesicles via lipid-based nanoprobes ;方法;;nEVs模型样品制备（该文把从细胞上清提取的外泌体称作模型样品） MDA-MB-231 培养于9个T75 flasks (Falcon) 2-3天，达80%融合。然后培养于SFM (无血清培养基) ， 48 h。（无血清培养基） 收集培养液，300 g?5 min；然后 16,500 g?20 min；弃掉细胞渣。用0.22 μ m (pore size) 滤膜过滤。 共收集108 ml 培养液后，4℃，100,000 g?2 h。 获得的nEV（纳米级外泌体）沉淀用200 μ l SFM重悬，400 μ l nEVs分装6份。 标准样品用于评价LNP分离 nEVs的效果，重复3次。 模型组样品用10 μ l DNase I (1 units /μ l; Life Technologies) 或5 μ g/ ml Rnase， 37 度2 h。上清存于? 80备用。;细胞摄取nEV实验 溶剂C配制nEVs 、再配PKH26染料。 用2 μ l PKH26 染料 (Sigma)混合上述nEV，孵育 5 min @ 4℃。再超离纯化。 细胞摄取：PKH26染料标记的 nEVs加于96孔板细胞中， 2 h@ 37度。 细胞用4% 多聚甲醛4℃固定10 min，然后用DAPI (1 μ g /ml)染色10 min@RT。 Olympus 显微镜40倍观察;用细胞优化LNP（脂质纳米探针） LP: FITC标记的C18–PEG、DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、胆固醇–PEG粉购于Nanocos公司。 FITC- PEGylated lipids 溶于无水乙醇，终浓度1 mM，存于? 80℃。 每种LP 10nmol 加于 250 μ l 溶剂C。 10^7 细胞重悬于250 μ l 溶液C或5% 人白蛋白(PBS)中。 LP加入细胞悬液，轻柔混合5 min@4 ℃， 500 g×5 min 去掉多余LP，然后4% 多聚甲醛10 min固定@ 4度。 用1.5 ml PBS重悬细胞, DAPI 染色@RT，PBS洗3次， 500 μ l PBS重悬。 20 μ l细胞悬液加到玻璃盖片上，用于荧光显微镜观察。荧光强度用ImageJ 软件分析。;捕获探针（CP）制备和特性. Fe3O4–SiO2核心-外壳亚微米颗粒用改进的St?ber sol–gel process。 30 mg上述Fe3O4 亚微米颗粒用超声分散于混合液体中：160 ml 乙醇, 40 ml 水，10 ml 浓氨水 (28% w/w)。 然后在超声状态下逐滴加正硅酸乙酯（Tetraethyl orthosilicate）0.3 ml , 然后搅拌3 h @RT. 所得产物用磁场分离，去离子水、乙醇洗涤，60℃、12h干燥.。 氨基活化MMPs（磁性亚微米颗粒）：250mg MMPs、250μl 3-丙基三乙氧基甲硅烷胺（3-aminopropyltriethoxysilane），超声分散于30 ml 甲苯（toluene）中。该混合物在氮气环境下回流(加热?)12小时。收集产物，甲苯、乙醇洗涤，80度过夜晾干。 颗粒形态用扫描电镜检测。 傅里叶变换红外光谱用 Bruker Vertex V70 检测。 5 mg氨基活化的MMPs，加入二甲基甲酰胺（含10%吡啶、1mM异硫氰酸苯酯isothiocyanate）2h。然后用二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水洗涤。 氨基活化前后的MMPs界面电位（Zeta potential）用Zetasizer (Malvern)测定。 去离子水溶625μg NeutrAvidin蛋白(NA，Life Technologies) ，链接 异硫氰酸酯-MMPs@37度、1h，然后1%BSA封闭，PBS洗3次。 上述新制的NA-包被MMPs立即用于nEV提取。;用LNP分离nEV. LP (生物素化的DSPE–PEG) 粉末溶于无水乙醇，终浓度1 mM ，存于 ? 20 度。 依据前述PKH26标记方法，用LP 标记nEV。 100 μl nEV模型样品加入 1 ml 溶液C；LP (0.001, 0.01, 0.1, 1, 5 ,10 nmol) 加入另外1 ml 稀释液C；4度轻柔混合样品 5 min ，和~10^12 CP (NA-MMPs) @RT 30 min混合。磁铁分离后，CPs 用PBS洗3次，去掉非特异吸附到CPs上的分子。电镜检测nEV-CPs。 用 稀释液 C,分装1,10,50,100,200 nmol的LP为500μl，加入100μl