淋巴细胞分离过程中去除红细胞与血小板方法.docVIP

为获得高纯度淋巴细胞，必须进一步清除PBMC悬液中其他血细胞。（一）去除红细胞：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。低渗裂解法是加1ml蒸馏水于沉淀的PBMC中，不超过1min，红细胞即快速裂解，立即加入等量的1.8%氯化钠溶液恢复为等渗状态，经洗涤即可去除红细胞。氯化铵处理法是在沉淀的PBMC中加入1ml 0.83%氯化铵溶液，轻轻振摇2min，即可裂解红细胞，经洗涤即可去除红细胞。红细胞裂解液的制备：碳酸氢钾（KHCO3）1.0g；氯化氨（NH4Cl）8.3g；EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至1000ml，即工作液。（二）去除血小板：通过离心洗涤，即可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清（FCS）梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。[将PBMC悬液洗涤2~3次后，常可去除绝大部分混杂的血小板。某些疾病状态下，外周血中血小板数量增多，常需通过胎牛血清（FCS）梯度离心才能去除过多的血小板，因FCS可让单个核细胞通过而阻止血小板通过。]Place 3 ml FCS in a 15-ml centrifuge tube and carefully overlay with PBMC. Centrifuge 15 min in a GH-3.7 rotor at 800 rpm (200 g), 18℃ to 20℃. Discard supernatant, which contains platelets. Resuspend pellet in HBSS/FCS at 2-5×107 cells per 1 to 2 ml. [Fetal calf serum (FCS; heat-inactivated 1 hr, 56（三）去除单核细胞和粒细胞：单核细胞的去除：①粘附去除法：单核细胞能粘附在塑料或玻璃的表面，而淋巴细胞则不能，由此可将单核细胞从PBMC悬液中分离出来。②L-亮氨酸甲酯去除法：单核细胞内富含溶酶体酶，而L-亮氨酸甲酯能被单核细胞摄入后聚集于溶酶体中，在溶酶体的作用下转化为L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯，此物对细胞有毒性作用，由此可溶解并去除单核细胞。此外本法还可清除NK细胞及细胞毒性T细胞，而B细胞及绝大多数T细胞因缺少溶酶体酶，因而不受影响。这种方法只适用于分离新鲜细胞，冻存细胞因代谢L-亮氨酸甲酯的能力很弱而不易分离。③羰基铁吞噬离心法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞比重增大，再经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，则单核细胞将沉于管底而被去除。实验时可先将抗凝血与一定量的羰基铁粉混合，在37℃下搅拌15min，亦可将已分离的PBMC悬液与羰基铁粉混合，然后再进行离心分离。此外，用针对单核细胞表面特殊标志的特异性抗体，通过间接免疫吸附法或免疫磁性微珠法亦可去除PBMC悬液中的单核细胞，且可对单核细胞进行回收利用。1. 黏附法：单核细胞和多形核白细胞具有黏附能力，通过PBMC与玻璃或塑料平皿的黏附作用，非黏附细胞即为淋巴细胞。同理，可应用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱清除黏附细胞，洗脱液中主要是淋巴细胞。优点：简便易行，对细胞损伤少。缺点：B细胞也有黏附能力，用此法分离时将有所损失。2. 羰基铁粉吞噬法：使单核细胞吞噬羰基铁粉后细胞密度增大：（1）经聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心使单核细胞沉积于管底而被去除；（2）用磁铁将细胞吸至管底，上层液中欧诺个即含较纯的淋巴细胞。3. 苯丙氨酸甲酯法：苯丙氨酸甲酯（PME）（或L-亮氨酸甲酯）具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体因渗透压改变而破裂，所释放的酶类物质可致细胞溶解。该法可溶解含溶酶体的细胞（如单核细胞、粒细胞和纤维母细胞等）。B细胞和多数T细胞因缺乏溶酶体酶，故不受影响。