第七章 细胞融合和应用.pptVIP

第七章 细胞融合与应用;第一节 细胞融合概述;细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。;Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。;生物种类;植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 ;动物细胞融合实验使用的小白鼠 ;三、动植物细胞的融合过程;四、细胞融合的意义;第二节 细胞融合的基本原理;显微镜下细胞融合过程;融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解;第三节 细胞融合的常用方法;一、仙台病毒法;病毒法的主要步骤;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 ;聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。 PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。 PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生 最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。;聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程;PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 ;（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。;PEG诱导的细胞融合过程示意图 ;三、电融合法;细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 ;电融合诱导法原理示意图;第三节 杂种细胞的筛选;杂种细胞筛选方法： 1．遗传互补筛选法 2．抗性互补筛选 3．生长特性筛选法 4．物理特性筛选法 5．其它方法;基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选;第四节 细胞融合技术应用举例 ;一、何谓单克隆抗体？;墒坠逐庄化淹素军躲冠钢豆洞殉晓常宫辽象螟施速铸耸蒋淡萧夕绘寸半炯第七章 细胞融合和应用第七章 细胞融合和应用;岔棺恩泛妇脂以槐那逸寅孤侥钉捂阵颓女潍磺竹酝锗锋柳关斟联企龟委耐第七章 细胞融合和应用第七章 细胞融合和应用;只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。;T淋巴细胞：即胸腺依赖淋巴细胞（thymus dependent lymphocyte）。亦可简称T细胞。来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。目前认为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和