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地高辛标记探针Southern 杂交
地高辛标记探针的Southern 杂交
(DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ,Cat.No.11 745 832 910,Roche Diagnostics GmbH,Germany)
1. 探针标记步骤(20μl 体系):
将10ng-1μg这个需要测好。可能是1μl也可能是4μl
这个需要测好。可能是1μl也可能是4μl。还可以是300ng-3μg。
沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟,使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。
充分混匀DIG-high Primer (1#管),并取4 μl至变性DNA管,混匀并离心?10秒钟,离心到管壁无水挂即可。。
?10秒钟,离心到管壁无水挂即可。
37 ℃温育1小时或过夜(最大到不超过20小时)。
停止反应,加2 μl 0.2M EDTA(pH 8.0)或65 ℃加热10分钟-20℃保存备用。
-20℃保存备用。
2. 探针标记效率检测:
将地高辛标记好的探针作一系列的稀释,点到一条尼龙膜上,同时用地高辛标记的control DNA作对照标准,120℃固定30分钟;然后用地高辛抗体免疫检测,按BNT/BCIP显色步骤显色;比较显色结果,选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下:
根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl,将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl),然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA
表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量
Template DNA
1 h
20 h
10 ng
45 ng
600 ng
30 ng
130 ng
1050 ng
100 ng
270 ng
1500 ng
300 ng
450 ng
2000 ng
1000 ng
850 ng
2300 ng
3000 ng
1350 ng
2650 ng
表2 探针DNA及Control DNA 系列表
Tube
DNA (μl)
From
Tube #
DNA dilution buffer(μl)
Dilution
Final concentration
1
?
Diluted orginal
?
?
1ng/μl
2
2
1
198
1:100
10 pg/μl
3
15
2
35
1:3.3
3 pg/μl
4
5
2
45
1:10
1 pg/μl
5
5
3
45
1:10
0.3 pg/μl
6
5
4
45
1:10
0.1 pg/μl
7
5
5
45
1:10
0.03 pg/μl
8
5
6
45
1:10总的稀释比例是:
总的稀释比例是:1:105
0.01 pg/μl
9
0
-
50
-
0
将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜
120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟
将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中,室温振荡2分钟
将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟
将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟
用10ml Washing buffer 洗2次,每次15分钟
在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟
将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡
当斑点或带显示出来后,用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟,照相
染色至0.1pg的Control DNA出现斑点,比较标记的探针与Control DNA 染色情况计算出地高辛标记的DNA 的量:如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色,则探针标记理想;如果0.1pg的对照显色, 0.1pg的标记探针没显色,但0.3pg显色,则计算探针浓度(约为理想浓度的1/3)以确定杂交时加多少探针(25ng探针/ml杂交液);如果0.1pg的对照显色,但标记探针0.3pg的斑点没显色,则应重新标记探针。
(转膜被省略。Capillary transfer1%琼脂糖凝胶,40V电泳过夜,切角标记。
Capillary transfer
1%琼脂糖凝胶,40V电泳过夜,切角标记。
对于植物基因组,去嘌呤实验不要超过20min。
去嘌呤缓冲液:place the gel in a plastic tray.cover with 250 mM HClpartial depurination.
partial depurination
agit
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