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实验一 MS培养基配制和灭菌 一．目的和要求： 1. 学会MS培养基的制作方法; 2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。 二、仪器与试剂 1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等 2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和 1N HCl 三、方法步骤 （一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L） No. 6-BA NAA IBA CK 0 0 1 0.5 0.1 2 1.0 0.1 3 2.0 0.2 4 1.0 0.2 5 2.0 0.2 （二） 配制培养基 (1) 溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。 (2) 各种母液的吸取：Macro-e 　50ml 　　　　　 Micro-e 1ml 有机成分　 1ml Fe盐　　 5ml 肌醇 10ml 加在一起，倒入烧杯（1L) （3）加入糖:称取 30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中。 （4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。 （5）定容:加蒸馏水（用量杯）。 （6）调节pH至5.8，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。 （7）分装:30～40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。 （8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。 （三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为0.12～0.15MPa,温度为120～126℃，保持15~20 min。 具体操作步骤： 1. 加水； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅； 3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀； 4. 加热； 5. 排除冷空气； 6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到 1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在 1Kg 压力(121℃)下灭菌 15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。 7. 灭菌时间达到 20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。 四.作业 1. 总结配制培养基的注意事项。 2. 制作培养基前为何要提前配制母液? 实验二 短柄五加无性系建立 一．目的和要求： 1. 学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作; 2. 掌握无菌操作技术。 二、材料、仪器与试剂 1.材料：短柄五加休眠枝 短柄五加( Eleutherococcus brachypus Harms. ) 为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原，逐渐被认为是濒危植物。其茎具有较高的药用价值，有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效。 2.仪器：超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿等 3.试剂：配制好的 MS培养基各种母液、1mol/L的NaOH、1mol/LHCL、0.1%的升汞、70%的乙醇。 三、方法步骤 (一) 无菌操作 准备阶段 接种室：1、紫外灯提前照20-30min。 2、70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。 操作人员：1、穿专用实验服，戴口罩。 2、剪短指甲，流水洗手三次。 操作阶段 清理工作台面，70%乙醇擦三次。 70%乙醇擦手三次。 3、避免说话和来回走动 (二) 无性系建立 1. 配制启动培养基 CK MS ① MS+6-BA 0. 5 mg/L + NAA0.1mg/L ② MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA0.1mg/L ③ MS+6-BA 2. 0 mg/L + NAA0.2mg/L ④ MS+6-BA 1. 0 mg/L + IBA0.2mg/L ⑤ MS+6-BA 2. 0 mg/L + IBA0.2mg/L 2. 材料的选择：选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。 3. 培养步骤： （1）外植体消毒： 去杂→流水水洗1～2h→70%乙醇（8-10s）→无菌水洗3-5次→0.1%HgCl2（10min）→无菌水水洗5次 （2）接种： 用剪刀将灭菌后的枝条剪成 长约1～1.5 cm的单芽茎段。将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种