探讨不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的比较研究.docVIP

　　探讨不同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的比较研究 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killercells，CIK)是一群异质性的具有抗肿瘤作用的细胞。CIK 细胞主要表达CD3 和CD56， 抗肿瘤活性强，增殖迅速。用患者自身PBMC 诱导的CIK 细胞已经显示良好的临床疗效，尤其对慢性髓系白血病、肝癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等。但是肿瘤患者在经历了放化疗后，经常出现白细胞减少、贫血等症状。尤其晚期恶性肿瘤患者每毫升外周血中单核细胞的数量也较正常人少。因此为了减轻患者负担，提高临床疗效，本研究比较了来自健康捐助者的脐血CIK 细胞和来自肺癌患者外周血的CIK 细胞在体外的抗肿瘤作用，并初步探讨了其机制上的差异，以寻找更有效可行的CIK治疗方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　白血病细胞系K562 和肺癌细胞系A549 由吉林省肿瘤防治研究所常规传代培养。Rebinant human interleukin (IL) -2、IFN-gamma;、CD3 -mAb (OKT -3)、IL-1alpha; 购自Biolegend。PI、anti-CD3-ECD、anti-CD56-PC5、anti -CD8 -PC5、anti CD3 -FITC、anti -CD8 -FITC及相应的同型对照抗体均购自贝克曼库尔特公司。5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester(CFSE)购自Molecular Probes。Annexin V apoptosis kit 购自BD公司。MonensinSolution(BioLegend，Cat.420701)。PEanti-human CD107a (Lysosome-Associated MembraneProtein 1，LAMP-1，BioLegend，Cat. 328608，Clone: H4A3)。CCK-8 购自碧云天生物技术公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 诱导培养CIK 细胞肺癌患者外周血(4 份， 　　10 mL/份)来自吉林省肿瘤医院住院患者(2014 年8 月～2015 年8 月);4 份脐血(10 mL/份)来自吉林省妇幼保健院(2014 年8 月～2015 年8 月)。血液样本分别经红细胞裂解液处理后， 获得的细胞被培养在IMDM 培养基中(10% FCS，37℃，5%CO2饱和湿度)，细胞浓度(1～2)106/mL。培养24 h 后，加入1000 U/mLIFN-gamma;，CD3-mAb (50 ng/mL)，IL-2(300 U/mL)，IL-1alpha;(100 U/mL)，继续培养并每3 天半量换液或扩瓶1 次，同时补加IL-2(300 U/mL)。在培养的第14 天和第21 天收获细胞，流式细胞仪检测分析(BeckmanCoulter Epics XL-MCL) 细胞表型， 即CD3+CD56 + 、CD3+CD8+ 细胞百分率。 　　1.2.2 CIK 细胞增殖实验采用CCK-8 染色法检测诱导培养21 d 的脐血CIK 细胞和来自肺癌患者外周血的CIK 细胞的增殖率。调整CIK 细胞的初始密度为5104/mL，37℃、5% CO2培养箱中培养，每3 天扩瓶1 次，CCK-8 染色， 酶标仪检测(490 nm)， 直到第21 天，计算增殖率并分析比较实验结果。 　　1.2.3 CIK 细胞体外抗肿瘤活性实验(流式细胞仪法) 　　标记靶细胞：A549 和K562 细胞用PBS 洗1 遍，调整细胞浓度为1.5106/mL，CFSE(2.5 mu;mol/L) 标记细胞，37℃孵育8 min，PBS 洗细胞1 次，加入1 mL IMDM(含10% FCS)，室温避光孵育10 min，再加入PBS 洗细胞1 次备用。标记效应细胞：调整CIK 细胞浓度为1106/100 mu;L，标记用CD3、CD8 和CD56 抗体，室温避光孵育30 min，细胞用PBS 洗1 次备用。调整靶细胞密度为5104/mL，设置不同的效靶比，分别为1∶1、5∶1、10∶1，相应的CIK 效应细胞浓度分别为5104/mL、25104/mL、50104/mL，分别设单独的靶细胞和效应细胞对照，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后，PI 染色，流式细胞仪检测分析。 　　1.2.4 CIK 细胞体外抗肿瘤活性实验(MTT 法) 按上述同样的效靶比将细胞接种于96 孔板中， 靶细胞浓度为2104/孔，37℃ 5% CO2培养箱中培养24 h 后，加入CIK 细胞，MTT 法检测CIK 对靶细胞的杀伤效率。酶标仪检测490 nm 处吸光度(A)值。抑制率(%)=