一、口腔粘膜脱落细胞采集二、口腔拭子基因组DNA 提取（天根Kit .PDF

一、口腔粘膜脱落细胞采集 注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前 30min 内请勿进食和饮 水。 1、洗净双手； 2、取出棉签； 3 、手持棉签，伸进口腔，从口腔内侧颊粘膜处（腮帮子内侧）反复擦拭 40 次以上（不时旋转棉棒），取出棉签； 4 、从试管盒中取出试管，打开管盖，将棉签头部伸入管中，用力掰断，将 棉签头部留在管内，并扣紧管盖。 二、口腔拭子基因组 DNA 提取（天根 Kit ，DP322） 使用前，请先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇，加入体积请参照 瓶上的标签。 1. 处理材料： 将在面颊内擦拭过的棉签转置于 2ml 离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆 上剪下，加入 600ul 缓冲液 GA。 注意:如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液(客户自备 ， 目录号:RT405-12) ，振荡15 sec ，室温放置5 min。 
 2. 加入40ul Proteinase K溶液，涡旋10 sec混匀，56°C放置20 min，其间每7 min涡旋混匀数次。 
 3. 加入600ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10 min。此时溶液应变清 亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液 转移至新的离心管中。 
 注意1: 加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70°C放置时会消失 ，不 会影响后续实验 。如溶液未变清亮 ，说明细胞裂解不彻底 ，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯 。 
 注意2: 如果由于拭子上细胞数少导致提取的基因组DNA少于1 μg ，可以在 添加缓冲液GB的同时添加Carrier RNA(客户自备 ，目录号:RT416)。 
 4. 加300ul无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。 
 注意:加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀 ，但不影响DNA提取 。 
 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入 收集管中) ， 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液 ，将吸附 柱CR2放回收集管中 。 
 注意：第4步液体总体积超过800ul，分两次转移。 6.向吸附柱CR2中加入500 μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇) ，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液 ，将吸附柱CR2 放回收集管中 。 
 7. 向吸附柱CR2中加入600 μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水 乙醇) ，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液 ，将吸附柱CR2 放回收集管 。 8. 重复操作步骤7。 9. 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，倒掉废液 。将吸附柱CR2室温放置数 分钟 ，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意: 这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除 ，漂洗液中乙醇的残留 会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。 10. 将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 20-50 μl 洗脱缓冲液TB ，室温放置2-5 min，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。 注意:洗脱缓冲液体积不应少于20 μl ，体积过小影响回收效率 。为增加基因 组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CR2中，室温放置2 min ， 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响 。若 用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内 ，pH值低于7.0会降低洗脱效 率;且DNA产物应保存 在-20°C ，以防DNA降解。 DNA浓度及纯度检测 得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素 有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯 度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链 DNA、40 μg/ml单链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用 ddH2O，比值会偏低，因为