30例结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶基因多态性检测.docVIP

30例结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶基因多态性检测【摘要】目的:研究结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性分布规律。方法:30例患者为研究组,30例正常人为对照组,采用聚合酶链反应(PCR),对入组的结肠癌患者外周血中ACE基因表达进行检测,以了解ACE基因插入型(ID型)、缺失型(DD型)和Ⅱ型3种基因型及I/D等位基因在结肠癌患者外周血中的分布规律,并进行统计学处理。结果:结肠癌患者外周血ACE基因插入/缺失(I/D)多态性分布:ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的占比分别为36.67%、6.67%、56.66%,I/D等位基因分布频率分别为53.30%和46.70%,对照组ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的占比分别为53.33%、16.67%、30.00%,I/D等位基因分布频率分别为43.33%和56.67%,两组间基因型分布频率和I/D等位基因分布频率均有显著差异(p70岁者;④原发性高血压病患者;⑤合并严重心、脑、肾、血液系统疾病患者;⑥精神病患者;⑦不愿意接受本研究措施者。 1.2患者情况年龄40-70周岁,其中男性18例,女性12例,临床分期Ⅰ-Ⅱ期者17例,Ⅲ-Ⅳ期者13例,结肠腺癌1例,结肠中分化腺癌10例,结肠中低分化腺癌3例,结肠乳头状腺癌2例,结肠溃疡性中分化腺癌2例,结肠粘膜浸润性腺癌1例,结肠中分化粘液腺癌1例,结肠低分化腺癌2例,结肠管状腺癌2例,结肠中分化管状腺癌6例。研究组与对照组除结肠癌外,在一般情况方面比较均无显著差异(p0.05)。 1.3DNA提取采用蛋白酶K消化酚-氯仿抽提法。 1.4引物合成和PCR扩增引物由上海生工合成,序列如下: ACE-Ⅰ-upper:5’-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3’ ACE-Ⅰ-down:5’-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3’ 扩增片段大小,插入型为597bp,缺失型为319bp。PCR扩增体系体积为25micro;l,反应体系含Taq酶1.0micro;l,10×buffer2.5micro;l,10mMdNTP0.5micro;l,引物(10pmol/micro;l)各0.5micro;l,模板gDNA约100ng。扩增条件:94℃预变性5分钟,然后94℃30”,56℃45”,72℃1分钟,共35个循环;最后72℃5分钟。试剂均购自Takara公司。对于基因型为缺失型纯合子(DD)型的个体再用特异性扩增插入片段的ACE-Ⅱ进行验证,如扩增出目的片段则为ID型。ACE-Ⅱ引物序列如下: ACE-Ⅱ-upper:5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3’ ACE-Ⅱ-down:5’-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3’ 扩增片段大小为335bp,退火温度为65℃,反应条件同ACE-Ⅰ。 1.5PCR产物检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳约30分钟,电压100v,在紫外灯下观察条带。Marker为DL2000。 1.6统计学处理采用SPSS12.0统计软件,组间频率比较采用X2检验,以p0.05有显著差异。 2结果 2.1PCR产物电泳结果 各标本取10micro;l产物加样,电泳,按常规摄片,因:ACEI/D多态性PCR检测结果。319bp片段(D等位基因)的表达及319bp和579bp片段(I等位基因)的同时表达表示ACE基因的DD,ID和Ⅱ几种基因型。M:标准对照;4,7,22,25和29:DD纯合子;1,3,8,10,11,13,14和17:ID杂合子;2,5,6,9,12和15:Ⅱ纯合子。 2.2基因型分析 ACE基因型的分布结果,研究组11例标本为缺失杂合子(ID型),占比36.67%(11/30);2例标本为缺失纯合子(DD型),占比6.67%(2/30);17例标本为插入纯合子(II型),占比56.66%(17/30);对照组:ID型、D型、II型的占比分别为53.33%、16.67%、30.00%,经统计分析,两组患者在ID型、DD型、II型基因的分布频率上有显著差异(X2=4.410,p0.05)。 结肠癌患者ACE等位基因检测结果,结肠癌患者组D和I等位基因的分布频率分别为43.33%和56.67%,正常对照组分别为70.00%和30.00%,结肠癌患者和正常人外周血ACED和I等位基因存在显著差异(X2=4.344,p=0.037)。我们还对ACE基因多态性和I/D等位基因进行了亚组分析,由于样本数量的原因,在性别、病理类型、临床分期、吸烟史及家族史等因素均未表现出对ACE基因表达的影响。 3讨论 血管紧张素转换酶-Ⅰ(AC