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微生物菌(毒)种保藏及管理文章编号：1004-9231(2007)02-0087-02 在微生物检验及研究工作中经常使用菌（毒）种。菌（毒）种是一种重要的生物资源。菌（毒）种保藏不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌（毒）种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础。保藏的菌（毒）种有的是开发利用的对象，有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经生物技术修饰改造获得的，都是有着极大的研究价值和开发利用的潜力［1］。因此，菌（毒）种的保藏工作至关重要。 菌（毒）种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌（毒）种在保藏和管理过程中不死亡，不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期使用。 1 菌（毒）种保藏［2］ 菌（毒）种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏。保藏方法有20多种，从总体上可分为4大类：传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法［1］。无论哪种方法，其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境，如低温，干燥，缺氧，营养缺乏等。简易的方法有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。不同类型或不同种属的菌（毒）种可根据生理特性选用不同的保藏方法。如产芽孢或孢子的菌种适用于干燥法，无抗逆性结构的细胞如酵母菌或某些种属的细菌可用定期移植法和液体保藏等方法。目前公认的长期保存微生物菌（毒）种的较安全、可靠的方法是冷冻法和冷冻干燥法，而其中制备和保存生物材料的最佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌（毒）种的保藏，因为它适用于大多数细胞结构的特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。其基本原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低细菌（或病毒）新陈代谢的速度，使细菌（或病毒）的生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的［3］。另外，保藏效果良好的还有液氮保藏法等。 2 保藏方法 菌（毒）种的保藏是微生物检验、教学科研和有关生产单位的一项重要工作［4］。在实际工作中应根据菌（毒）种的种类和需要选用不同的保藏方法［5］。通常通冻干燥真空法最佳，但在一般条件下，限于设备等诸多情况，常采用其它保藏方法。如定期移植法，此法简单易行，不需要特殊设备，能随时观察所保藏的菌株是否死亡、变异或污染杂菌，缺点是经常移植易发生变异或污染空气中的杂菌。用此法保藏菌（毒）种常用的有：琼脂斜面、半固体穿刺、鸡蛋斜面、血斜面或血高层保存、沙土保存等［6］。 2.1 传代法 分传代培养保藏法和液体石蜡覆盖保藏法，前者有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养（培养厌氧细菌用）等，培养后于4―6℃冰箱内保存。 2.2干燥法 也称载体保藏法（滤纸、沙土），是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏方法，沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 2.3 冷冻法 分低温冰箱保存（-20―-30℃，-50―-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮冻结（-196℃）等保藏法。 2.4 冷冻干燥法 先使微生物在极低温度（约-70℃）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护剂溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、糖类、甘油、二甲亚砜等。 3 常用标准菌种保藏法 在微生物实验室中，常需保藏一些实验中常用的标准菌种及菌株，如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、几种常见的沙门菌、志贺菌等。因此对这些菌种的妥善保藏是良好的实验室管理和实验质量的重要保证［7］。 标准菌种保藏的核心是必须确保标准菌种与检测有关的关键的形态学、生物化学或遗传学特性。菌种的保藏方法必须根据各类微生物的特点采用合适的方法保藏。长期、稳定保藏的菌种采用冷冻干燥法保藏保留菌种；日常检测工作需要经常移种或传代用工作菌种。工作菌种一般保存于半固体琼脂，上层加封液体石蜡或其他方式，并根据标准菌种种类情况而存放于4℃―8℃、室温或其他合适的温度及其他相应的环境条件［8］。微生物实验室标准菌种的一般保藏方法有以下几种： 3.1 斜面保藏法 3.1.1 普通肉汤琼脂斜面 肠道杆菌、葡萄球菌等营养要求不高的细菌接种于普通琼脂斜面上，置37℃培养18―24 h后，放于4℃冰箱中，可保藏1个月，每经1个月需接种传代1次。 3.1.2 血琼脂斜面 链球菌及肺炎球菌的营养要求较高，在普通培养基上生长不良或不生长，应接种于血琼脂斜面上，37℃培养生长后，放4℃冰箱保存，链球菌需0.5―1个月接种1次