药品微生物检验菌种保藏方法.docVIP

药品微生物检验菌种保藏方法[中图分类号]11954 [文献标识码]B [文章编号]1672-4208(2009)11-0076-01 菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法是微生物检验中一项重要工作，特别是《中国药典》2005年版要求对药品的无菌检查和微生物限度检查进行方法学验证，并规定所用标准菌种的传代次数不得超过5代。因此，菌种的纯度、活性、变异可直接影响检验结果，采用一种适宜的菌种保藏方法至关重要，可保持菌种原有的各种生物学特性，从而达到研究和检验目的。 1 菌种保藏的目的和原理 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究的实验目的。菌种的保藏首先应挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等；其次为人为地创造环境条件(如干燥、低温和缺氧)。使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态；并且尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株。 2 菌种的保藏方法 各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好有效的保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。常用的保藏方法主要有斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、砂土管保藏法、麸皮保藏法、甘油悬液保藏法、冷冻真空干燥保藏法、液氮超低温保藏法等。 2.1 斜面低温保藏法一常用保藏法　将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏，主要保藏措施是低温，一般可保存1～6个月左右，优点是简便易行，容易推广，存活率高，缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2.2 石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(可半固体穿刺培养物)上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加硅胶并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。此法的主要保藏措施是低温、阻氧，一般可保存1～2年左右。 2.3 冷冻真空干燥保藏法　又称为冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法，该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。 2.4 液氮超低温保藏法 简称液氮保藏法或液氮法，它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温(-196℃)下保藏的方法，其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏，其主要保藏措施是超低温、有保护剂、保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一，此法的做法是操作简便、高效，且可使用各种培养形成的微生物进行保藏，其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。 菌种的保藏对药品微生物检验起着至关重要的作用，在平时保藏工作中，一定要根据不同的菌种特性和自身的设备条件选择不同的保藏方法，才能保证菌种的纯度和活性，达到研究和药品检验的需求。 1