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蛋白质定量研究探究进展【关键词】蛋白质；定量分析；研究 【中图分类号】R【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0049-02 1蛋白质定量检测的生物化学方法 1.1凯氏定氮(Kjeldahls Method)及分光光度法利用蛋白质含氮量进行检测的经典方法，优点是定量准确，但操作烦琐，仅用于标定蛋白质标准品和校正其他测定方法。凯氏定氮法有半微量法、微量法及全量法。样品与H2SO4一同加热消化，分析有机物，释放出的NH3与结合，碱化蒸馏使氨游离，硼酸吸收，HCI或H2SO4标准溶液滴定，从而计算蛋白质的含量。该方法是以Hantzsch反应为原理所建立的一种测试蛋白质含量的新的分光光度法。适用于各类食品中蛋白质的测定，且不需要特殊的凯氏定氮装置。取样且少，消化时间短，精密度高准确度好，适用于大批样品同时测定，亦适用于微量蛋白质分析，是一种蛋白质快速、准确测定的新途径。 1.2双缩脲法(Biuret Assay)双缩脲法简便易行，但检测灵敏度相对较低，最低测定值100μg。必须在测定前先使蛋白完全沉淀，除去干扰物质，才能得到较准确的结果。除三氯乙酸作沉淀剂外．还可用钨酸、磷钨酸和Tsuchiya试剂，双缩脲法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近、干扰物质少，不受温度的影响。但灵敏度低，0.01吸光度相当于l66.7μg蛋白，且操作复杂，很难用于自动化仪器分析。 1.3Lowry法（Lowry Assay）结合双缩脲法中铜盐反应与Folin-ciocalteau试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基Tyr和Try的迅速反应与肽链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应．而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色、在波长750nm处测定Amax。 1.4BCA法(Bicichoninic Acid Assay)BCA法的灵敏度为0．5～10μg/ml，其最低测定值与反应温度有关。有37℃和60℃(增强法)2种反应温度：在37℃时，一般适用于浓度较高的样品(＞50μg/ml)，但是色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化(37℃时该方法检测的蛋白质浓度范围为20～2000μg/ml)；在60℃(增强法)时，一般适用于浓度较低的样品(＜50μg／ml)，色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化，因此能大大提高检测灵敏度(60℃时该方法检测的蛋白质浓度最低可达5μg/ml)。 1.5丹宁酸法丹宁酸用来沉淀蛋白质，但沉淀结构松散。可用Caiilne取代蛋白，蛋白游离出后用免疫法或空氮法测定，但此法操作麻烦、加FeCl3与丹宁酸蛋白沉淀反应显色，5min后在510nm比色，0.1mol的丹宁酸可结合0.333μg白蛋白、灵敏度达5ml#8226;L-1，线性范围为0.05～1.8g#8226;L-1。 1.6浊度法(比浊法)利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白浓度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂。30g#8226;L-1磺基水杨酸作为沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白。50g#8226;L-1三氯乙酸蛋白作沉淀剂，可沉淀白蛋白和球蛋白。 1.7染料结合法(Dye Combination Assay)是利用蛋白质与染料结合的性质进行检测的方法。常用的染料有：考马斯亮蓝(coomassie bril1iant blue，CBB)G-250或R-250、丽春红S(ponceau S)、氨基黑(amido black)、溴甲酚绿(bromcreso1 green，BCG)和溴甲酚紫(bromcreso1 purple，BCP)等。 1.8紫外分光光度法(ultravio1et Spectrophotometry)是利用蛋白质在紫外280nm处有最大吸收峰的现象，进行检测的方法，具有简便、快速且可回收样品的优点。紫外分光光度法检测蛋白质的最低测定值为10Pg。 1.9荧光法这是近几年兴起的一种新的定量测定蛋白质的方法，观已报道的络天青S、次氯酸盐―硫胺素及白蛋白蓝670法测定蛋白质的方法，其灵敏度较低。 1.10金属离子-染料结合法借用金属离子－染料和蛋白质在适宜条件下反应进而检测蛋白的方法发展很快，钛-4，5-二溴基荧光酮(DBPF)-Tween-80与蛋白质的显色反应用来测定微量尿蛋白。在pH2．9，血清蛋白能与钛-DBPF-Tween-80形成蓝色络合物．λmax＝605nm，加入少量乙醇能提高方法的灵敏度及稳定性。 2蛋白质定量检测的免疫法 2.1免疫扩散法所谓抗原是指引起机体产生抗体的物质，而抗体是指在抗原的刺激下机体产生的物质。抗原与抗体结合生成沉淀以达到机体免疫的目的，抗原与抗体属于蛋白质化