组织对氧磷酶1PON1有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒.docVIP

组织对氧磷酶PON1）有机磷酸酶活性光度法对氧磷酶PON1）有机磷酸酶活性光度法对氧磷酶对氧磷酶（parapxonase；PON；EC3.1.8.1）是一种水解酯类（esters）、有机磷酸酯（organophosphate）和内酯（lactone）的酶，分成三个亚型：PON1、PON2、PON3。结构同源性在基因层面上达70%，在氨基酸层面上达65%。其中PON1，为钙离子依赖性和高密度脂蛋白（high density lipoprotein；HDL）相关性糖蛋白，含有354氨基酸，43Kd分子量，分布在肝脏、肾脏、小肠和血清中。具有有机磷酸酶（organophosphtase）、磷酸三酯酶（phosphotriesterase）、芳香酯酶（arylesterase）和硫内酯酶（thiolactonase）等活性水解各种氧化性磷酯芳香族和脂肪族内酯，杀虫剂对硫磷（parathion）降解产物对氧磷（paraoxon）、毒死蜱chlorpyriphos）、神经毒因子沙林（sarin）和索曼（soman）同型半胱氨酸（homocysteine）硫内酯、二氢香豆素（dihydrocourmarin；DHC）、γ-丁内酯（γ-butyrolactone）延缓低密具有芳香酯和内酯酶等基于底物对硝基苯磷酸二乙酯diethyl-p-nitrophenylphosphate），在对氧磷酶1的作用下，水解产生对硝基苯磷酸二乙酯，通过对硝基苯吸收峰值的变化（4nm波长），来定量分析对氧磷酶的有机磷酸酶活性。反应系统为： 产品内容 缓冲液（Reagent ） 毫升 液（Reagent ） 毫升阴性液（Reagent ） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存 底物液（Reagent ）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent ）有效保证6月用户自备 1.5毫升离心管：用于样品的容器15毫升锥形离心管：用于样品的容器（微型）台式离心机：用于样品制备 比色皿或96孔板：用于的容器 分光光度仪或酶标仪：用于分析 实验步骤 样品准备 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量 （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管 （选择步骤）加入毫升 清理液（Reagent A）清洗1次 移入到一个液氮冻存管 即刻放进液氮罐过夜 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融） 放进一个15毫升锥形离心管 加入预冷的微升 裂解液（Reagent B） 转移到预冷的1.5毫升离心管 强力涡旋震荡30秒，充分混匀 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用） 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 测定准备 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长4nm，间隔分钟，读数次（共分钟），并置零 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化缓冲液（Reagent ） 背景对照测定 移取微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿加入微升 底物液（Reagent ） 上下倾倒数次，混匀 在37℃温度下孵育分钟 加入微升 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内） 即刻放进分光光度仪检测，此为背景对照（分钟读数－0分钟读数） 样品测定 移取微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿加入微升 底物液（Reagent ） 上下倾倒数次，混匀 在37℃温度下孵育分钟 加入50微升待测样品（100微克蛋白） 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内） 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（分钟读数－0分钟读数） 五、计算样品活性 测定 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品 分别移取微升 缓冲液（Reagent ）到96孔板分别加入微升 底物液（Reagent ） 轻轻摇动96孔板 在37℃温度下孵育分钟 分别加入待测样品（20微克蛋白）到孔 轻轻摇动96孔板 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和分钟读数 注意事项 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作 操作时，须戴手套底物液（Reagent ） 系统测试过程中，背景测 加样后3秒内测定 测定值由低到高变化；测定可持续分钟 测定后，比色皿须清洗彻底 样本测定分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微