苏南丘陵区紫花苜蓿菌核病病原研究和防治初报.docVIP

苏南丘陵区紫花苜蓿菌核病病原研究及防治初报 张薇1 胡跃高1＊张力群2 储国良3 100094 2. 中国农业大学植病系，北京100094 3. 江苏省镇江市农业科学研究所，句容 212400 [摘 要] 本文通过对核糖体转录间隔区（ITS）序列分析，结合形态学特征对采自苏南丘陵地区的苜蓿菌核病菌NJ1进行病原鉴定，确定病原菌为三叶草核盘菌（Sclerotinia trifoliorum）。对该病原菌生物学特性研究表明，菌丝生长最适温度为18~23℃，最适pH值为5~9。病原菌对硫酸铵L-半胱氨酸利用能力差；对甘露醇和乳糖利用最好，D-果糖和D-木糖利用较差,不能利用柠檬酸。用平皿法比较化学药剂对病原菌抑菌杀菌能力，其中根必治、速克灵和万霉净3000倍液可完全抑制病菌生长，温室生测表明根必治防效最好。从当地苜蓿根际土壤中筛选到三种有效生防细菌，平皿对峙试验中S1和S2抑菌效果较好，抑菌带达到或超过1.5cm，温室生测S2生防效果最好，防效达67.5%。 [关键词] 苜蓿菌核病，Sclerotinia trifoliorum，ITS，防治 随着苏南丘陵区苜蓿生产扩大，发生了严重的菌核病害。病原菌在田间形成可以越冬（夏）的菌核，以菌丝形态在田间大量侵染，造成苜蓿减产和品质降低。国外对苜蓿菌核病原菌生理生化特性、发病生态因子及防治方面研究较多，如1978年美国植病学会举行的Sclerotinia学术讨论会上所报道的菌丝适宜生长pH值为2.5~9[1]，二十多种化学药剂[2]和盾壳霉、木霉菌等生防菌[3]可以防治菌核病。我国自发现苜蓿菌核病后一直没有病原菌的鉴定报道。由于核糖体基因转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）在真菌种间存在丰富的变异，该区域的DNA酶切图谱以及序列分析为真菌分类、鉴定提供了一个强有力的工具[4]。基于此，Carbone和Kohn在1993年[5]就已经研究了核盘菌科（Sclerotiniacceae）核糖体DNA的ITS1之间的差异，Holst-Jensen 等1998年利用ITS研究了核盘菌及其近缘属间的系统发育[6]。 本研究通过克隆核糖体转录间隔区，结合形态学特征对病原菌进行鉴定；以碳、氮源，温度，酸碱度等生理指标研究病原菌生物学特性；运用平皿法和盆栽法筛选出几种有效的杀菌剂和生防菌，并对病害防治进行了初步探索。 1材料与方法 1.1病原鉴定 1.1.1形态学特征观察 病原菌菌核于2001年9月采自江苏省句容市磨盘乡潘冲村苜蓿病区土壤。将菌核表面消毒后置于PDA平皿中25oC培养72h，取边缘菌丝于新鲜PDA平皿中培养72h，在显微镜下切取菌丝尖端约1mm，进行纯培养，得菌株NJ1。将采集到的子囊盘和PDA平皿上生长的菌核用1％NaClO表面消毒3min，切片于显微镜下观察。 1.1.2 ITS区的克隆与序列分析 菌丝基因组DNA提取如文献［7］所述。采用引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）[8]，以菌株NJ1菌丝基因组DNA为模板扩增ITS片段。PCR程序如下：95oC变性5min；95oC 40sec，52oC 40sec，72oC 1min，共30个循环；72oC延伸10min。PCR产物连接pMD18-T（TAKARA公司），转化Escherichia coli DH5α。重组质粒命名为pMD18-ITS，并测序（上海申友生物技术有限责任公司）。应用BLAST对序列同源性比较（/blast/Blast.cgi）。 1.2温度对菌丝生长的影响 在培养2~3d的菌落边缘打孔，转接至PDA平皿中央，每皿1片菌饼。分别在2、6、10、15、18、20、23、25、28、33和37℃下培养。每处理4个重复，每天定时测量菌丝生长直径，依文献［9］所述方法计算菌丝平均生长速率。 1.3酸碱度对菌丝生长的影响 用1mol/L的HCl和NaOH调PDA培养基pH值，梯度设为3~13。在培养2~3d的苜蓿菌核病菌落边缘打孔，各处理平板中央接种直径为7mm菌饼，4个重复，23℃恒温培养，每天定时测量菌落直径，并计算平均生长速率。 1.4碳源和氮源对菌丝生长的影响 以查彼(Czapek)培养基[10]作为基本培养基。分别用等量的乳糖、淀粉、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、柠檬酸、D-果糖、D-木糖置换其中的蔗糖；分别用等量的谷氨酸、硫酸铵、硝酸钾、L-天冬碱、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸置换硝酸钠，配成不同碳源和氮源的培养基,调pH7.0。设无碳、无氮和水琼脂对照。平皿中央接菌饼，23℃下培养，4次重复，每日定时测量菌落直径。 1.5杀菌剂对病原菌的杀菌毒力 实验采用12种杀菌