4染色体分析相关的试验.DOC

第二篇　细胞的遗传物质 第四章　染色体分析相关的实验 ?染色体是细胞与分子联系的重要桥梁，染色体的研究在遗传学和医学研究中被广泛重视及应用。尤其是染色体畸变有关的各类遗传病的研究使临床分析上了一个新的台阶。 在染色体分析技术实验中，染色体非显带分析技术相对较简单，通常采用外周血中的淋巴细胞。外周血染色体制备也是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术。此外，产前诊断时，胎儿可采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确的识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。G（G banding）显带技术是目前通常采用的显带技术之一，另外，Q显带、高分辨显带、C显带、T显带及SCE技术等也被用于染色体研究。 随着分子细胞遗传学技术的应用，可利用克隆的DNA探针(含有荧光标记) 来定位染色体上特定基因和DNA序列，如荧光原位杂交（FISH）技术，可以鉴别经典细胞遗传学方法所难以识别的微小标记染色体、微小缺失和复杂易位等。 在一般的生理状态下，全血中含有红、白细胞二类，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核无分裂能力；白细胞虽有细胞核存在，但是在外周血中已处于休止期（G0），因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物。 现在最常用的促使分裂的药品是植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA），它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞，这就为染色体的制备创造了条件。在PHA的作用下，处在G0期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂，当体外培养至70 h左右时，大多数淋巴细胞己处于第二增殖周期内，此时用秋水仙素（colchicine）处理细胞可使正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗处理、固定、染色，获取的中期分裂相细胞。染色体标本，可在显微镜下拍照进行核型分析，或用计算机进行图像分析。 （一）器械 超净工作台、酒精灯、5m1无菌注射器、5号针头、10ml培养瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、水平式离心机、定时钟、试管架、量筒、10ml刻度离心管、冰玻片，毛细滴管、恒温水浴箱、恒温培养箱、托盘天平、光学显微镜。 （二）试剂 RPMI1640、小牛血清、肝素(500U/ml)、秋水仙素(5μg/ml)、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为3∶1，现用现配）、0.075mol.L-1KCI低渗液、Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、5％NaHCO3。 采血与接种 用一次性5ml注射器取500U/ml的肝素0.2-0.3ml湿润针筒后，然后将多余的肝素排除。常规消毒被检者肘部皮肤，从肘部静脉采血2ml。转动针筒以混匀肝素；随后在超净工作台中将血液滴入盛有5ml培养液（4ml RPMI l640、lml小牛血清，0.2ml PHA，用5％的NaHCO3调pH至7.0～7.4）的培养瓶内，每瓶0.3～0.5ml（7号针头约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。 培养 将培养瓶放在37℃恒温箱内培养72h。 在终止培养前2h，将5μg/ml的秋水仙素1～2滴（5号针头）加入培养瓶内（终浓度为0.07μg/ml），轻轻摇匀．放回温箱内，继续培养2h。 染色体标本的制备胰蛋白酶法收获细胞用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入10ml刻度离心管内，平衡后放入离心机内，离心8～10min（1000r/min），弃上清液。 低渗处理加8ml预温（370C）的0.075mol.L-1KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放在37℃恒温水浴锅中，静置15～20min，使白细胞膨胀，染色体分散（精确的低渗时间应自行摸索）。 固定预固定：低渗处理完成后，加入现配制固定液1ml，吹打均匀。1000 r/min离心8～10min，弃去上清液。 固定：沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀， 1000 r/min再离心8～10min，弃去上清液。 再固定：再加入新配固定液8ml，打匀（静置30min），1000 r//min离心8～10min，弃去上清液。 制片视细胞多少，加入适量新配固定液制成细胞悬液，将细胞悬液2-3滴，滴到清洁的冰玻片上，在酒精灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾干。 染色晾干的标本用Giemsa染液（Giemsa原液∶pH6.8磷酸缓冲液为1∶9）染色8～10min、自来水冲洗、晾干。 镜检 将制备好的染色体玻片放置到显微镜下，先用低倍镜找到分散良好的分裂相，然后后换高倍镜、油镜、认真观察。 1．PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用200~300μg/ml，每毫升培养液加0.2～0.3ml，浓度过高可能会导致