生物化学与分子生物学基本试验试验一蛋白质的盐析与透析试验.DOC

生物化学与分子生物学 基本实验 实验一 蛋白质的盐析与透析 实验目的 了解蛋白质的盐析与透析的原理和意义 实验原理 血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、α、β球蛋白和γ-球蛋白三种。详情见盐析技术。另选择适宜孔径的半透膜，使蛋白质分子被截留，小分子的中性盐透出而达分离的目的。但透析时正负离子透过半透膜的速度不同，如硫酸铵中的NH4+的透出较快，膜内SO42-剩余而生成H2SO4，其酸度足以使蛋白质变性，因此，除盐时开始应对0.14 mol·L-1的NH4OH透析。本实验分别用双缩脲试剂和Nessler试剂检验蛋白质和NH4+的存在。 仪器材料和试剂药品 仪器材料：（1）离心管、试管及试管架。 （2）2m1刻度吸管、玻璃棒、小烧杯。 （3）透析袋。 （4）离心机。 试剂药品：（1）饱和硫酸铵溶液。 （2）硫酸铵粉末。 （3）双缩脲试剂 称取CuSO4·5H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。另取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·H2O）10g和KI 5g，溶于500ml蒸馏水中，再加入20％氢氧化钠300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液中，加蒸馏水至1000ml。此液可长期储存。 （4）Nessler试剂 称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力振摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。 取贮存液150ml，加10％氢氧化钠700ml，混匀后加蒸馏水150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。本试剂需有适宜的pH值，调节至用1 mol/L盐酸20ml滴定时，需本试剂11.0ml～11.5ml时为宜。 （5）血清样本。 实验内容 1、取2m1血清加入离心管中，再加入2ml饱和硫酸铵溶液，用玻璃棒搅匀，静置5～10分钟后，用2000rpm离心5分钟，将上清液移至另一离心管中，分次加入少量硫酸铵粉末，并用玻璃棒搅拌至有少量硫酸铵不再溶解为止，静置5～10分钟后，同上离心，得沉淀和上清液。 2、取在蒸馏水中煮沸约1小时的15mm×60mm透析袋一条，一端打结后检查是否漏水，不漏则将水倒掉，加入用3ml蒸馏水溶解的第二次沉淀液，挂于盛有蒸馏水的小烧杯中，使袋内外的液面处于同一水平，透析约30分钟，每隔10分钟更换一次透析液。 3、检查 取6支试管，按下表操作。 表3-2-1 试 剂 （滴） 管 号 1 2 3 4 5 6 袋内液 10 10 — — — — 透析液 — — 10 10 — — 蒸馏水 — — — — 10 — 饱和硫酸铵 — — — — — 10 双缩脲试剂 10 — 10 — — 10 Nessler试剂 — 10 — 10 10 — 混匀后观察并记录结果。 思考题 1、透析时如何防止蛋白质变性？ 2、两次沉淀的蛋白质各为何种蛋白质？ 实验二 凝胶层析法分离蛋自质 实验目的 1、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和方法。 2、了解核酸-蛋白质检测仪和部分收集器的工作原理和使用。 实验原理 凝胶层析法主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散移动速度各异而使大小不同的分子得到分离的方法。当加在凝胶床表面的混合物随洗脱液进行洗脱时，分子量大的物质阻滞作用小，沿凝胶颗粒的间隙下流，流程短、而移动速度快，先流出层析床，分子量小的物质阻滞作用大，能够进入凝胶颗粒的网孔内，流程长、而移动速度慢，后流出层析床。本实验用葡聚糖凝胶G-75分离牛血清清蛋白（分子量67000）与溶菌酶（分子量13930）两种蛋白质，用核酸－蛋白质检测仪进行检测或用双缩脲反应观察结果。 仪器材料和