叶绿素的提取与含量测定.doc

实验报告 课程名称： 植物生理学实验 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 实验目的和要求： 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。 掌握定量分析的原理和方法。 实验内容和原理： 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2．皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3．取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5．定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 三、实验材料与试剂 材料：青菜叶 试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸 四、主要仪器设备： 1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机 2．研具、PE管、酒精灯等 五、操作方法和实验步骤（必填） 1．定性分析： 荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆 ，过滤入三角瓶，观察荧光现象 皂化反应： 加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O 1ml，分层后观察 取代反应：加醋酸约1ml，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变 亮绿 色 2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） ，在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nm OD 0.5-1） ，分别测定叶绿素的吸收峰 3．叶绿素定量分析： 鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份0.2ml 加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 六、实验数据记录和处理 1．荧光现象：透射光 绿 色，反射光 红 光 2．皂化反应：上层呈 黄 色，为 类胡萝卜素 ，吸收 蓝紫 光。 下层呈 绿 色。为 叶绿素 。吸收 蓝紫光和红 光。 皂化反应分层 3. 类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定： 上层黄色溶液扫描光谱 吸收峰为468nm、439nm、413nm、667nm和606nm 五个 下层绿色溶液扫描光谱 吸收峰为414nm、526nm、639nm三个 4．取代反应： 加醋酸约1ml，变褐（ 去镁 叶绿素） 取1/2加醋酸铜粉加热变 亮绿 色，为 铜代 叶绿素。 去镁叶绿素 铜代叶绿素 5.叶绿素含量测定 波长/nm 吸光度（第一组） 吸光度（第二组） 645 0.068 0.072 652 0.093 0.095 663 0.164 0.170 根据公式： Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645 Cb(mg/L)=22.9OD645-4.68 OD663 CT(mg/L)= OD652(1000/34.5 Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000） (2/ 0.1 (5/ 0.2 Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000） (2/ 0.1 (5/ 0.2 Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000） (2/ 0.1 (5/ 0.2 求得： Ca1= 1.899 mg/L Ca2=1.965 mg/L Cb1=0.790 mg/L Cb2=0.853 mg/L CT1=2.696 mg/L