环境生物学实验指导.docVIP

环境生物学综合实验 —— 重金属污染对土壤微生物群落结构的影响 一、实验目的 （1）通过实验验证重金属污染对土壤生物学性质的影响。 （2）了解Cu、Ni和Cr元素对土壤微生物的潜在毒性。 （3）掌握土壤中细菌群落结构的分子测试方法 （4）掌握重金属对土壤微生物性质影响和评价的研究方法。 二、实验原理 微生物群落结构是表征土壤生物学性状的重要指标。土壤受到重金属污染后，重金属的毒性亦能够对土壤微生物产生影响，可表现为微生物的多样性改变、微生物数量降低以及酶活性变化。细菌作为土壤微生物的主要组成部分，其群落结构的变化可敏感地反映出土壤受到重金属污染的剧烈程度。细菌的群落结构可以用其优势种群的数量来表示。 16S rDNA序列分析是区分不同细菌种群的有效方法之一，它可鉴别生物物种的遗传多样性。本实验依据不同细菌之间具有的遗传多样性差异特征，利用细菌的16S rDNA通用引物，通过PCR技术，收集扩增产物，再利用限制性内切酶对其进行酶切分型，统计不同酶切类型及其所占的比例，进而获得细菌多样性的信息。利用不同重金属污染环境下细菌多样性变化的特征，评估不同污染物对土壤细菌群落结构的影响程度。 三、实验仪器 （一）实验的主要仪器 培养箱恒温摇床PCR仪电泳仪凝胶成像仪超净工作台冷冻离心机离心机水浴锅灭菌锅移液（10μL、50μL、200μL、1mL、5mL） （二）器皿 1000 mL烧杯用于土壤培养；150 mL锥形瓶用于土壤悬液的振荡，100 mL离心管用于菌液分离，直径为80 mm的培养皿用于微生物平板鉴定。 另外，配备1000 μL、200 μL、20 μL吸头盒及吸头，1.5 mL离心管各一盒，预先进行灭菌处理，置于超净台中保存。 四、实验试剂 （一）主要生化试剂 1. 2 mmol/L焦磷酸钠溶液称取0.446 g焦磷酸钠溶于水中，移入500 mL容量瓶，用水定容至刻度。 LB液体培养基称取.0 g蛋白胨，5 g酵母浸粉， g NaCl于烧杯中，用量筒量取1 L蒸馏水，将其加入烧杯中，置于垫有石棉网的电炉上微微加热，用玻璃棒不断搅拌，待试剂全部溶解后，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值为7.0。℃,35 min），冷却后分别倒入10个已灭菌过的150 mL锥形瓶中，用灭菌的棉球封口，置于超净台中保存，供接种时使用。 3. LB平板培养基称取.0 g蛋白胨，5 g酵母浸粉， g NaCl及12 g琼脂粉于烧杯中，1 L蒸馏水，电炉上加热，用玻璃棒不断搅拌，待试剂全部溶解后，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值为7.0。℃,35 min），冷却到85℃左右时，小心取出，在超净工作台中分别倒入培养皿中，每只皿的体积大约17-20 mL，静置至平板固化。置于超净台中保存，供接种时使用。 4. 异丙醇 75%乙醇：量取75 mL无水乙醇100 mL。 5×KCM：称取3.72 g氯化钾，2.21 g二水氯化钙，5.08 g六水合氯化镁溶于水中，移入100 mL容量瓶，用水定容至刻度。50×TAE?Buffer?配制：称量Tris?242g，Na2EDTA.2H2Og于1L烧杯中向烧杯中加入约800m去离子水，充分搅拌均匀加入57.1m的冰乙酸，充分溶解用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。使用时稀释50倍或100倍1×TAE或?0.5×TAE溴乙啶染色液（EB10mg/mL。在1 L去离子水中加入大约500 μL的EB液体试剂，溶液稍微变红即可，置于搪瓷盒中，用于琼脂糖电泳胶的染色。注意EB属于强致癌物，必须小心操作。 9. 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油琼脂糖 采集土壤样品自然风干磨细过孔径 1mm 筛。浓度单位：mg/kg项目 级 别 一级指标 二级指标 三级指标 自然背景值 ＜6.5 6.5-7.5 pH＞7.5 Cd ≤ 0.2 0.3 0.3 0.6 1 Hg ≤ 0.15 0.3 0.5 1 1.5 As 水田≤ 15 30 25 20 30 旱地≤ 15 40 30 25 40 Cu 农田≤ 35 50 100 100 400 果园≤ — 150 200 200 400 Pb ≤ 35 250 300 350 500 Cr 水田≤ 90 250 300 350 400 旱地≤ 90 150 200 250 300 Zn ≤ 100 200 250 300 500 Ni ≤ 40 40 50 60 200 称取制备好的土壤样品30 ℃下静置培养7 d，使重金属与土壤微生物充分的发生作用。获得模拟重金属污染的土样。 不同重金属浓度的溶液 （二）微生物菌液制备 制备接种液时，离心管中，90