超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术.doc

实训三 超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术 实验原理： 通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。 实验材料与方法： <一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用. <二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100或G150）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000, 考马斯蓝G250 , 磷酸 ，乙醇（AP） ， 牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), 甲硫氨酸( methionine) , NBT（氮兰四唑 Nitroblue Tetrazdinna）, 核黄素 , EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）, <三>仪器: 离心机 WFZ-UV2000 型紫外分光光度计 201×7（717）强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂 匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、移液管、玻璃棒、 <四>实验方法和步骤： 称量25g 绿豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm）15Min 取清液，取少量样为样①，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。 所得清液测量总体积，缓慢40％饱和（NH4）2SO4 至浓度为19.4g/100ml，4℃冰箱静置分层。 离心（3000rpm） 取清液，取少量为样②，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。 步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）（过程充分搅拌），5℃至分层，离心（3000rpm） 取沉淀，取样③，计算SOD总活性单位及活性单位。 装入透析袋中，于蒸馏水中5℃透析过夜。 透析后溶液用滤纸过滤得清液，重新装入透析袋中用PEG浓缩。 装柱：1）排气泡 加蒸馏水 留15％体积水 2）100mL G100 一次装完 3）静置10min 打开出液口 排过量洗脱剂 4）保留离胶面2－3cm 接洗脱瓶 平衡30min 理想流速 △注意 ①胶面始终保持水层 ②洗脱瓶：pH7, 0.02MPb 8. 层析过程 ①样品：浓缩液 离心 过滤 体积31mL 取样④ ②上样：5％上样量2－3mol ③洗脱:1mL/min,3mL/支，共收100－120mL *测（1）A280值 （2） 三、结果与讨论： <一> SOD活性及蛋白质测定结果： 1．蛋白质含量测定： 表1. 牛血清制作蛋白质标准曲线（牛血清单位为0.1mg/ml） 蛋白质(mg) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.050 A(nm) 0 0.088 0.192 0.239 0.341 0.415 图1. 牛血清制作蛋白质标准曲线（牛血清单位为0.1mg/ml） <二 >硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩过程 表2. 连苯三酚测样品SOD活性(A325) 连苯三酚/ul 酶/ul △A’ 样① 50 50 0.021 样② 55 20 0.025 样③ 57 48 0.033 表3. 考马斯蓝G-250测样品蛋白含量(A595)： 样品体积/ul 第一次测量 第二次测量 OD平均值（nm） 样① 10 0.566 0.558 0.562 样② 10 0.291 0.293 0.292 样③ 120 0.115 0.120 0.118 根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量： 样① 0.067mg 样② 0.035mg 样③ 0.016mg （三）葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD实验结果 表4. 葡聚糖G100凝胶层析洗脱曲线（以A280吸收作为蛋白质含量的相对值） 试管号 （1） （2） （3） （4） （5） (7) 吸光值(nm) 0.059 0.079 0.019 0.083 0.048 0.044 0.04 　 　 　 　 　 　 　 　 试管号 (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) 吸光值(nm) 0.024 0.021 0.03 0.017 0.031 0.023 0.018 　 　 　 　 　 　 　 　 试管号 　（15） （16） （17） （18) （19) (20)