一凝胶色谱法-于都中学.PPT

课题3 血红蛋白的提取和分离 (一)凝胶色谱法 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 （一）样品处理 1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。 4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。 采集得到血样 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 磁力搅拌器 利用透析袋透析 透析过程 （二）凝胶色谱操作 （1）凝胶色谱柱的制作： 装配好的凝胶柱 收集得到的纯化后的血红蛋白 例1、回答有关蛋白质分离和纯化的问题 （1）要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行 处理，然后将 装入透析袋中除去 。 （2）要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？ 。 （3）下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质是 ，含负电荷最多的球蛋白是 ，相对分子质量最大的球蛋白是 。 （4）电泳是目前应用最为普遍的 蛋白质的方法。 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白 5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物 返回 纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱 材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填: 2.凝胶色谱柱的装填： ⑤ ④ 操作要求 ③ ② ① 步骤 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 （2）凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱 3.样品加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 3.样品的加入和洗脱 返回 离心 血细胞 小分子物质 加蒸馏水使其胀破 清蛋白 a1球蛋白 γ-球蛋白 （分离）纯化 知识总结 血红蛋白的提取和分离 蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组 成 作 用 蛋白质的 提取分离 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 B B B A C D C * 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 专题5 DNA和蛋白质技术 一、基础知识: 学生活动1: 1 、分离生物大分子的基本思路是什么？ 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？ 3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质