体外冷冻卵细胞技术的研究进展.ppt

yjm*梅 概念 历史回顾 冷冻原理 卵细胞的冷冻 冷冻方法 存在问题及展望 卵细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使卵细胞在-196℃的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存卵细胞的技术。 概念 历史回顾 1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠胚胎。 1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细胞得到活仔。 1977年，Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。 1985年，Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。 1986年，Chen等运用慢速冷冻卵子方法，诞生了世界首例冷冻试管婴儿。 1999年首次运用玻璃化冷冻技术冻存人类的胚胎并获得健康女婴的出生。 目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。 冷冻原理 低温冷冻保存的细胞能长期保存而不丧失活性，其原因是因为细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被低温所抑制，细胞内所有化学变化处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存。低温保存的细胞以一定方式复苏后，又具有存活能力。 细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐受低温，而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性作用（致死性温区-50~-15℃） 一、卵细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制 在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水分渗出产生溶液效应。 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生两种情况： （1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解。 （2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。这个因素影响是卵细胞冷冻保存的关键。 在-5~-15℃细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶就会迅速聚集，释放潜热引起温度瞬间剧增，造成过冷损伤。 冷冻的卵细胞解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。 卵细胞在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。 冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳定性而导致染色体异常。 二、保护措施 诱发结晶 溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温时才结晶，这种现象叫过冷现象，易对卵母细胞造成损伤。为了防止过冷现象的发生，通常在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。 诱发方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部；②在冷冻液中加入制冷剂 晶母等。 使用冷冻保护剂 冷冻保护剂作用原理：当冷冻保护剂渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成。在浓度增加到一定程度后，整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，避免“胞内冰晶损伤”。此外，保护剂可改变细胞膜通透性，降低细胞内外渗透压差，避免“溶质性损伤”。 非渗透性保护剂 这是一类大分子化合物，能溶于水，但不能渗入细胞，较为常用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。在快速冷冻时，可协助渗透性保护剂促使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成；组成玻璃化液时，可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化的相变温度升高、可促进胞质及保护液玻璃化；解冻时，为卵母细胞和胚胎提供一个高渗环境，避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。 其他保护剂 主要是指最近所发现的一些新型冷冻保护剂，如抗冻蛋白（AFP）。 渗透性保护剂 渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能够渗透进入胞质内而得名，常用的有甘油（GL）、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类物质在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：①防止细胞因脱水过度收缩；②与水分子发生水合作用，减慢溶液结晶速度；③稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减少盐害作用的产生。 玻璃化的保护作用 玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。 卵细胞的冷冻 成熟卵母细胞的玻璃化冷冻的已经运用于临床，未成熟卵的冷冻目前仍处于探索阶段 在临床上的卵泡采集中，成熟的卵母细胞只可以来源于新鲜的超