试验碱性磷酸酶比活力测定.PPT

实验 碱性磷酸酶比活力测定 实验目的 掌握酶活性测定方法的一般原理方法 测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力 实验原理 酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反应的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学反应速度表示。 酶催化的反应速度越快，酶活性越高，反之则愈低。 底物减少量或生成物增加量 酶促反应速度v = 单位时间 酶促反应进程曲线 要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正比的这一段时间内进行初速度的测定。 活力测定中应注意的几个问题 (1) 活力测定一般测定产物增加速度为好。 (2) 测活过程应注意外界环境的影响。 a b =a/b 方法： 1.终止测定法（终点法） 终止测定法是在酶和底物反应达到预定的时间时，立即加入终止剂使酶变性，终止酶促反应，在这段反应时间里面，产物的生成量基本成线性增加，用这段反应时间内的平均速率代替反应初速率。 2.动力学分析法（连续监测法或速率法） 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase ，简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。 对-硝基苯磷酸二钠法 碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解反应，以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm 值的增加计算酶活力的大小。 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。 碱性磷酸酶 酶活力单位定义为：在37℃下，以0.5 mmol/L pNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 ?mol pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。 磷酸苯二钠法 在pH10 环境中，ALPase催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算酶活性的大小。 反应式如下：磷酸苯二钠+H2O 苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物 碱性磷酸酶 操作方法 1 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）： 取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 pNP含量 (?mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.5?mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm 以对硝基苯酚的绝对量(?mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(?)值。 ?＝8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1 管 号 空白 1 2 3 5 mM pNPP(mL) 各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL H2O (mL) 各0.50mL 混匀，37℃，5分钟 酶液（mL） / 各0.1mL 37℃，精确反应10分钟 0.2 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0