基于克隆测序技术的人类白细胞抗原基因高分辨率分型方法 - 分析化学.PDF

第42 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究报告 第11 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2014 年11 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1574 ~1579 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.140494 基于克隆测序技术的人类白细胞抗原 基因高分辨率分型方法的建立 1,2 2 1,2 *1,2 1,2 邢晓清 摇 初亚男摇 项 铮 摇 宋沁馨 摇 周国华 1(药物质量与安全预警教育部重点实验室,中国药科大学,南京210009) 2(南京军区南京总医院药理科,南京210002) 摘摇 要摇 运用优化的扩增和克隆测序技术,建立了人类白细胞抗原(HLA鄄B)基因的高分辨率分型方法。 针 对HLA鄄B基因保守区序列设计引物进行等位基因扩增,基于质粒不相容原理将杂合型等位基因有效克隆入 质粒DNA 中,经细菌培养后进行 Sanger测序,根据测序结果经 ClustalX2 软件分析和IMTG/ HLA数据库的 BLAST 比对即可完成HLA鄄B基因的高分辨率分型。 利用建立的方法对7 例临床样本进行了HLA鄄B基因分 型,并且与第三方直接碱基序列分析基因分型技术(PCR鄄SBT)进行比对,结果完全一致。 本方法无需专业分 型软件,准确度高,成本低;采用通用引物进行等位基因的扩增和测序,无需传统方法中繁琐的引物设计和过 程优化,实现了HLA鄄B基因的高分辨率分型。 关键词摇 人类白细胞抗原鄄B基因;克隆测序技术;Sanger测序;高分辨率基因分型 1摇 引摇 言 人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)是由一系列紧密连锁的基因座位所组成的具有高 度多态性的复合体,是机体免疫系统的重要组成部分,在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用, 与人类疾病的发生、发展和预后密切相关。 HLA鄄B基因位于6号染色体短臂6p21.3 区域,该基因的多 态性非常复杂且主要位于第2 和第3号外显子,第2 和第3号外显子的总长度约550 bp左右,目前已发 现的近千种基因型绝大多数是基于第2 和第3号外显子的多态性进行分型的。 研究发现,HLA鄄B基因与药物不良反应密切相关。 例如,卡马西平为广谱抗癫痫药物,已广泛用于 治疗精神疾病,但部分病人服用该药后会出现毒性副作用SJS/ TEN(Steven鄄Johnson综合征/ 中毒性表皮 * 坏死松解症),严重时会导致死亡。 由于HLA鄄B 1502等位基因与卡马西平诱导的SJS/ TEN密切相关, * 2007年12 月美国食品药品监督管理局发布通知,告诫 HLA鄄B 1502 等位基因阳性者服用卡马西平可 能发生严重和潜在致命的皮肤反应,并推荐患者开始使用卡马西平前,需进行血液基因筛查;2011年, [1] * Chen等 发表了对台湾4877 例大样本研究的结果,进一步证明HLA鄄B 1502基因的检测可以显著降 低由卡马西平引起的SJS/ TEN发病率。 又如,别嘌呤醇是临床上治疗慢性原发性和继发性痛风的药物, [2] * Somkrua等 对HLA鄄B 5801基因与别嘌呤醇诱导的SJS/ TEN的进行了Meta分析,表明两者存在明显的 [3] * 相关性。 再如,阿巴卡韦