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第九章 核酸分子杂交技术与应用 第一节 核酸分子杂交的基本原理与分类 定义:单链核酸分子在合适的温度和离子强度下,通过碱基互补形成双链杂交体(hybrid)的一类技术,称作核酸分子杂交。 一、核酸分子杂交的基本原理 变性:融解，双螺旋氢键断裂,形成单链； 复性:单链探针与靶DNA单链之间形成杂合体DNA(异源核酸分子)，即为核酸杂交。 二、核酸分子杂交分类 (一)按分子: DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交 (二)按标记: 同位素与非同位素杂交 (三)按介质: 液相杂交、固相杂交、原位杂交 (四)基因芯片技术 固相杂交 1、菌落杂交：筛选重组菌落 2、Southern杂交:（靶核酸是DNA） 3、Northern杂交:（靶核酸是RNA） 4、点杂交和狭缝杂交 第二节 杂交反应的影响因素 一、长探针杂交 （一）影响杂交速率及杂化分子稳定性： ◆核酸分子浓度: 浓度↗,杂交速率↗,本底和非特异杂交↗. ◆碱基组成: G+C含量↗,杂交速率↗,影响杂化分子Tm。 ◆盐溶液的浓度： 浓度↗,杂交速率↗,稳定性↗. ◆温度: 低于Tm20Co-30Co时,温度↗,杂交速率↗. ◆其他: 甲醛、碱基错配比例、加速剂等. （二）酶联对探针及杂交的影响： （三）杂交反应体积: （四）杂交的时间: 二、短小寡核苷酸探针杂交 （一）影响杂交稳定性的因素： 1、融解温度(Tm): 50%杂化核酸分子解链温度。 （胺盐、碱基错配比例） 2、盐浓度 （二）杂交时间: 依复杂性，一种或多种探针 （三）杂交加速剂: 一般不用 （四）洗脱条件 （五）杂交条件的优化:杂交或洗脱温度盐浓度 第三节 探针的设计(1) 一、探针的种类： DNA、RNA、寡核苷酸探针 （一）DNA探针：单链、双链 不易被降解 （二）RNA探针：效率高、易被降解 （三）寡核苷酸（ASO）探针：可大量合成 第三节 探针的设计(2) 二、探针标记方法的选择： ●放射性标记：32P ●非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素 三、探针的长度： ●DNA、RNA探针：400-500bp ●寡核苷酸探针长度：F=(1/4)L×2N 。 第四节 核酸分子与固相介质的结合 一、支持介质的类型： 硝酸纤维素薄膜(NC)、尼龙膜等。 二、靶核酸分子的转移： 1、从克隆菌落转移DNA 2、从凝胶胶上转移DNA ●毛细转移: 毛细管虹吸（Southern印迹） ●真空转移： 三、核酸的固定： 烘烤、紫外光固定、碱固定。 第五节 探针的标记 一、全程标记： ◎随机引物法； ◎DNA切口平移标记法； ◎全程RNA标记； ◎化学法全程核酸标记。 二、末端标记： ◎5′末端标记； ◎3′末端标记。 第六节 杂交与杂交后检测(1) 一、杂交 ◆预杂交： 目的是封闭可能发生非特异性杂交的部位----降低本底。 ◆杂交：探针与靶序列孵育。 ◆洗脱：目的是洗脱未特异性杂交的探针。 第六节 杂交与杂交后检测(2) 二、杂交标记物信号的检测： (一)放射自显影 (二)非放射性标记的检测 1、直接检测：显色反应、化学发光 2、间接检测： ELISA、多探针检测、化学发光物检测。 三、滤膜和探针的重复使用 第七节 核酸分子杂交方法评价及应用 一、斑点/狭缝杂交方法的评价及应用 二、Southern杂交方法的评价及应用 三、Northern杂交方法的评价及应用 四、原位杂交方法的评价及应用 本章总结 1、核酸分子杂交： 单链探针与靶DNA单链之间形成杂合体DNA(异源核酸分子)，即为核酸杂交。 2、基本原理： 变性（融解）、复性 3、核酸分子杂交分类 ●按分子: DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交 ●按标记: 同位素与非同位素杂交 ●按介质: 液相杂交、固相杂交、原位杂交 4、探针的设计 ●探针的种类： DNA、RNA、寡核苷酸探针 ●探针标记方法： 放射性标记、非放射性标记 5、杂交： 预杂交、杂交、洗脱。 6、Southern、Northern杂交方法的应用 作业 1、试述核酸分子杂交技术的原理及过程 2、简述探针的种类和标记方法 * * 李建平 原位杂交: 切片组织细胞中基因定位. *