CTE-RHA复合核酶抑制HCV RNA复制探究.doc

CTE-RHA复合核酶抑制HCV RNA复制探究【摘要】目的 建立HCV亚基因复制子稳定转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶-CTE复合物对HCV RNA的影响。方法 在脂质体介导下，经G418筛选抗性克隆，建立HCV 亚基因复制子稳定转染细胞系。用RT-PCR证实转染成功。观察四种核酶对HCV亚基因复制子稳定转染细胞中HCV RNA的影响。结果 两种复合核酶转染组扩增目的条带亮度明显低于对应普通核酶转染组。结论 新型复合核酶(带有CTE)在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。 【关键词】丙型肝炎 核酶 基因治疗 中图分类号：R394.8文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）3-060-03 丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒，是引起病毒性非甲非乙肝炎和输血后肝炎的重要病原体。核酶是一类能对特定序列的RNA进行切割、具有催化功能的小RNA分子。通过核酶技术抑制HCV的复制和表达已经成为近年来的研究热点。Warashina M等[3]报道将核酶联接到D型逆转录病毒的胞浆转运信号序列CTE(constitutive transport element)后，由于CTE具有解旋酶A（RHA）的结合序列，RHA能与CTE结合，使核酶能到达任何需要切割的位点。我们通过建立HCV亚基因复制子的稳定转染细胞株，并根据现有文献分别针对HCV 5-NCR序列最易（195位点）和最难（150位点）切割的位点设计相应的核酶和带有CTE的新型核酶，观察在细胞内各自对HCV RNA的切割效率，比较各自对相应位点的切割效率以及新型核酶和普通核酶的切割效率有无差异，为丙肝的有效治疗提供新的思路。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 人肝细胞株QSG7701，PRC/CMV为空载体，PBM4-5 HCV，细菌JM109菌株由本实验室保存，DMEM高糖培养基（GIBCO公司），胎牛血清（四季青公司），G418筛选剂。 引物：β-actin(592bp)上游引物：5-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’ 下游引物：5-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’由北京奥科生物科技公司合成 NS5A（314bp） 上游引物：5-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT-3’ 下游引物：5-CGAGCTCATGATGCACGGTC-3’由长沙瑞晶生物公司合成 oligo(dT)18 由长沙瑞晶生物公司合成 1.2 稳定转染细胞的制备 分别将扩增后提取的质粒PBM4-5 HCV和空白质粒PRC/CMV转染QSG7701细胞，继续细胞培养，然后加入含筛选剂G418的正常培养基进行筛选，对细胞进行换液、消化传代1月，再对阳性克隆采取RT-PCR进行鉴定获得稳定表达HCV-RNA的QSG7701细胞。 1.3 核酶对QSG7701细胞中HCV RNA表达的影响 按照LipofectmineTM2000说明书中的转染程序，分别将新型核酶和普通核酶的四种质粒分别导入细胞。细胞分为七组：空白对照组1（不加质粒）、空白对照组2（转染空载体PRC/CMV）、转染PPHCV5-R1组、转染PPHCV5-R2组、转染PPHCV5-CR1组、转染PPHCV5-CR2组、阴性对照组（正常QSG7701细胞）。转染前一天，将适量细胞消化接种于6孔培养板，待细胞贴壁且密度达70％左右时进行转染，每孔用量：质粒DNA2ug + 脂质体6ul。转染48小时后取细胞进行下一步实验RT-PCR，观察各质粒对HCV RNA表达的影响。以β-actin为内参，观察各质粒对HCV RNA表达有无影响。 2 结果 2.1 稳定转染细胞组RT-PCR鉴定 图12 稳定转染细胞组RT-PCR鉴定 M：DNA Ladder；1：正常QSG7701细胞（作为阴性对照）；2：空白质粒转染组；3：目的质粒转染组；4：以质粒DNA为模板进行PCR组（作为PCR阳性对照）（各细胞组均以β-actin为内对照） 转染PBM4-5 HCV组细胞RNA经RT-PCR后可见大小为314bp的扩增片断，证实稳定转染成功，并说明在细胞内稳定表达HCV RNA，不能排除目的基因整合至宿主细胞基因组的可能，但这并不影响HCV RNA的表达，也不影响下一步试验；转染空白质粒组细胞RNA经RT-PCR后只可见592bp大小的β-actin扩增片断，无314bp大小的扩增片断，但细胞具有G418抗性并可稳定传代，由此推定空白质粒转染成功；正常QSG7701细胞组也只有592bp大小的β-actin扩增片断，提示RT-PCR结果可靠。 2.2 普通核酶和复合核酶对稳定转