柑橘组织培养.docVIP

柑橘的组织培养 柑橘的组织培养是柑橘生物技术研究的重要组成部分。上个世纪70 年代以来,柑橘组织培养技术在器官的发生、发育以及生理机制等基础性问题到应用性课题如种苗快速繁殖、无病毒苗木获得、种质资源离体保存等方面的研究都取得了一定的成绩，尤其在品种改良、新品种育成以及遗传转化等相关领域都取得了不少成果，组织培养实际上是应用现代生物技术进行柑橘育种的最基本也是最重要的的平台，虽然在成果转化和应用方面还有需要解决的问题，但是以生物技术提升柑橘科研水平，进而转化应用，依此加速柑橘产业的全面升级的目标应该是明确的。 1 成年态柑橘茎尖诱导和微芽嫁接 成年态柑橘茎尖诱导指从柑橘成年树上获取茎段芽的茎尖作组培外植体，诱导成苗的技术途径。目的是：是用再生苗的茎尖微芽嫁接达到柑橘脱毒或用于种质资源离体保存等。尤其在遗传转化的研发中，一般用无菌播种的实生苗节间及上胚轴切段作为外植体,虽有再生率高,其耐受性好,操作比较简单,是较理想的转化受体的优点,但是这类外植体用于再生体系及转化往往处于幼龄阶段,转基因植株需经过一个相当长的童期才能开花结果,这使得对转基因植株性状的评价和利用周期太长，而以成年态茎段为外植体离体培养再生苗可以克服童期长的问题。 （1） 外植体消毒方法—间二消毒法 成年态柑橘茎段或其它器官、组织作组培培养物，初代培养材料取自自然生长的植株,都带有各种各样的微生物,若消毒不成功就导会致失败，只有对这些材料进行成功的消毒,才能进行进一步的培养研究. 材料消毒措施的力度越大,灭菌效果越好,但是消毒剂对植物材料又具有毒害作用,特别是常用的升汞,不但有残毒,而且对环境的污染也比较严重.有研究报道，0. 5 cm长的柑橘纵切茎段外植体污染率较低，用70 %的酒精处理30 s, 10 %的次氯酸钠溶液处理30min,放置48 h后,再用10 %的次氯酸钠溶液处理30min,成功率最高。高温干燥季节取材,污染率较低。这种消毒方法的优点在于:用次氯酸钠作为消毒剂,处理以后残毒能够自然降解,避免了对环境的污染,因而优于用升汞处理；间隔2 d再进行第二次灭菌处理,残存的微生物孢子萌发后被杀死,不仅大大降低了污染率,同时也没有对材料造成大的损伤,因而成功率较高.称之为“间二消毒法”. （2） 成年态柑橘茎段再生体系 ①鱼橙等成年态茎段培养技术 材料与方法： 供试柑橘品种是GL橙、AW 橙、鱼橙和霜橙四个杂交种，树龄约15 年。春、秋季在柑橘树上选取长10～20 cm 且长势一致的半木质化枝条，去掉叶片（保留叶柄基部）和刺，用0.1%洗衣粉溶液清洗干净，再用自来水冲洗10 min，备用。在超净工作台上将枝条切成含腋芽约1 cm 的茎段外植体，并用0.1%升汞溶液消毒表面2 次，2次消毒间隔时间为1 d。茎段消毒后进行纵切或横切，将含腋芽的部分作外植体进行培养。 培养基： 腋芽诱导培养基。基本培养基为MT＋7.0 g/L 琼脂＋30 g/L 蔗糖，pH 5.7±0.1 GL橙为MT+ BAP（6-苯甲基腺嘌呤）1.0 mg/L+IBA（吲哚-3-丁酸）0.1 mg/L； AW橙和霜橙为MT+BAP1.0 mg/L+IBA0.2 mg/L； 鱼橙为MT+BAP0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L。 结果观察： 诱导启动、继代培养。 将柑橘成年态茎段接种在以MT 为基本培养基， 培养温度26±1℃，相对湿度60%，光照强度2 000lx、光照14 h/d。诱导培养4 周后，将整个茎段外植体转接于新的培养基增殖扩繁培养（培养条件与诱导培养相同），每隔4～5 周继代1 次，并在继代培养过程中逐步除去老茎段组织。结果表明：GL 橙成年态茎段在BAP 1.0mg/L+IBA0.1 mg/L 培养基中的诱导效果最好， 腋芽萌发率达82%以上，且诱导的腋芽数多、长势强；在BAP0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L 培养基中，鱼橙成年态茎段的腋芽诱导效果最好；而BAP1.0 mg/L+IBA0.2 mg/L培养基最适合于霜橙和AW 橙成年态茎段腋芽的诱导和生长。 增殖扩繁。 为了减少诱导腋芽的愈伤化，在继代培养过程中逐步除去老茎段组织。调查结果显示， 将GL 橙、AW 橙和霜橙3 个柑橘品种的成年态茎段接种在8 个不同植物生长调节剂配比的继代培养基中均不能增殖，腋芽愈伤化严重，导致大量腋芽从基部脱落，随后植株逐渐死亡。调查结果还显示， 将鱼橙成年态茎段接种，当BAP 浓度高于0.2 mg/L时腋芽的增殖系数较大（5～10 倍），但愈伤化程度严重；当BAP 浓度较低于0.1 mg/L时，腋芽增殖系数仅为1～3 倍，但腋芽生长势强；而IBA 添加浓度无论是0.1 mg/L 还是0.2 mg/L，对鱼