ELISA 酶联免疫分析.ppt

* Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。 Tween-20 非离子型表面活性剂，可以抑制蛋白质吸附与塑料表面 * * 光度酶联免疫吸附分析ELISA 邹 腊 娜 2016.11.30 概述 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）法，即酶联免疫吸附分析，是由Engvall和Perlmann及van Weeman 和Schuurs同时建立起来的。 抗原抗体 特异性 可逆性 完全抗原 半抗原 Schematic representation of the cascaded hybridization chain reaction for amplified miRNA sensing 酶 酶的要求： 纯度高，专一性强，催化反应效率高 具有足够多的偶联用标记基团，用各种化学方法与抗原、抗体偶联结合后，仍保持较高的催化活性 使用稳定性和保存稳定性好 待测液中不存在与标记酶相同的酶、底物、反应抑制剂等干扰物质 测定酶活性的方法简便、灵敏、快速 酶的来源、纯化和供应较方便 ELISA原理 必要试剂： 免疫吸附剂：固相的抗原或抗体 结合物：酶标记的抗原或抗体 酶反应的底物 固相载体 吸附性能好，空白值低，板底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近 聚苯乙烯 微量反应板（8 × 12/96孔）、小珠 包被封闭 包被：pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释 封闭：0.05%—0.5%牛血清蛋白 戊二醛交联法 4-40℃范围，pH6.0-8.0 过碘酸盐氧化法 只适用与含糖量较高的酶——辣根过氧化物酶（HRP） 常用酶 酶 底物 显色反应 测定波长/nm 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 OPD 橘红色 492 四甲联苯胺 TMB 黄色 450 碱性磷酸酯酶 对硝基磷酸苯酯PNP 黄色（对硝基苯酚） 405 β-D-半乳糖苷酶 邻硝基苯-β-D半乳糖苷 ONPG 黄色（邻硝基苯酚） 405 双抗夹心法 固相载体 封板蛋白 抗体 抗原 底物 酶标抗体 间接法 固相载体 封板蛋白 抗体 抗原 底物 酶标抗抗体 竞争法 固相载体 封板蛋白 抗体 抗原 底物 酶标抗原 三抗夹心法 固相载体 封板蛋白 抗体 抗原 底物 酶标抗抗体 抗酶抗体法 A种动物 固相载体 封板蛋白 第一抗体 抗原 底物 第二抗体 第三抗体 酶 B种动物 ELISA的应用 临床医学、动植物检验检疫、出入境检验检疫、食品科学、转基因产品、药物残留、病虫害防治 试剂盒的组成 TMB H2O2 试剂基本成分 洗涤缓冲液（pH7.4 PBS）： KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KCl、0.05% Tween-20 稀释缓冲液 洗涤缓冲液+1%的牛血清蛋白 终止液 强酸/强碱 其他酶联免疫分析方法 化学发光酶联免疫分析 以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过测定发光反应光强度的敏感性检测标本中抗原或抗体的含量。 荧光酶联免疫分析 在酶联免疫中引入荧光底物，此类底物被酶分解后，其产物可产生荧光。 电化学酶联免疫分析 酶催化底物发生相应的水解、氧化、或还原反应，产生或消耗一种电化学活性物质，再用适当的电化学技术进行检测。 Thanks for your attention 所有抗体分子的基本结构相同，它是由二硫键链接的4条肽链组成的对称结构，其中两条长链为重链（H链），两条短链为轻链（L链），4条链通过链间二硫键形成Y形。 * 固相抗原/抗体 保持其免疫活性 酶标抗原或抗体 既保持其免疫活性，又保留酶活性 * 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。 包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。 这种物理吸附是非特异性的，可能会吸附其他抗体、抗原产生背景，所以需要进行洗涤以及封闭。 封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛