生物化学研究技术PPT3 SDSPAGE鉴定菠萝蛋白酶纯度.pptVIP

SDS鉴定菠萝蛋白酶的纯度;一、实验目的;二、实验原理;影响电泳的主要因素 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳。 这种凝胶是由丙烯酰胺单体(简称 Acr)和交联剂 N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。;聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，即化学聚合和光聚合。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵[(NH4)2S2O3](简称Ap)，催化剂是N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺(TEMED)。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。;聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。 每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度，用T％表示。 凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C％表示。;不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳，带电颗粒在电场中的泳动有电荷效应、分子筛效应还具有浓缩效应。 (l) 浓缩效应 (2)电荷效应 (3)分子筛效应 ;Gel;实验试剂配制 ;(5) 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8): 取6g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液40ml，调pH至6.8，定容至100ml 。 (6) 10%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液: 取5g SDS加水定容至50ml。（加热溶解） (7) 2×电极缓冲液(0.1%SDS–0.05mol/L Tris–0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容至１000ml（配好的溶液pH8.3）(12个组可配2升,使用时再稀释2倍)。 ;(8) 样品溶解液：取SDS ２g，β-巯基乙醇 ５ml，甘油10ml，溴酚蓝0.1g，0.5mol/L pH6.8 Tris–HCl缓冲液 (浓缩胶缓冲液)10ml，加蒸馏水25ml，(最后的总体积为50 ml),装于棕色瓶。 (9)染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450 ml 甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至1000 ml。(12个组可配2000 ml) (10)脱色液 高甲醇1000ml：甲醇 454ml，冰醋酸75ml，dH2O 471 ml 低甲醇1000ml ：甲醇 50ml，冰醋酸75ml，dH2O 875 ml;七．实验步骤 1.清洗并吹干玻璃板。 2.在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。 3.把玻璃板放入电泳槽中。 4.用小烧杯加6ml蒸馏水，2ml 30%凝胶储液，20 ul TEMED，100ul 10％过硫酸铵，混匀，迅速倒入封口槽处(一定要快！)，静置约10min直到凝固。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 5.加dH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。;6.按下表用小烧杯配12%分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子约1～1.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为15～30min，胶与水分层，倾倒去水。; 7.凝好胶，垂直拔掉梳子（不要左右摇梳子）。 8.上槽加入电泳缓冲液（电极缓冲液稀释2倍），液面需没过低玻璃板；下槽电泳缓冲液没过玻璃板封胶处1cm。 9.用1.5ml ep管取100μl粗酶样品与100μl样品溶解液混合均匀，与蛋白质分子量标准一起置于沸水浴5min）。;10.微量注射器按下表2点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗微量注射器）。 表2 点样方式;11.上槽接负极，下槽接正极。 12.恒电流电泳：浓缩胶，10~12 mA，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶的界面调整电流至20mA。 13.待溴酚蓝迁移到距分离胶底部0.5~1cm处，结束电泳。 14.染色（20～30min），回收染色液。 15.脱色：高甲醇60~80ml，25min；高甲醇40~60ml 20min；低甲醇80~100ml完全脱净;16.拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率（蛋白相对迁移率＝蛋白迁移距离/指示剂迁移距离）。 17.用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线，求待测样品亚基的相对分子量。 18.以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标(X)，标准蛋白质分子量的对数为纵坐标(Y)，绘标准蛋白质的标准曲线，再根据样品相对迁移率在曲线上求出其蛋白质的分子量。;蛋白名称 ;低分子量标准蛋白质的组分： 1) 兔磷酸化酶B 分子量 97,400 2) 牛血清白蛋白 分子量66,200 3) 兔肌动蛋白 分子量43,000 4) 牛碳酸酐酶 分子量31,000 5) 牛蛋白酶