第三章 细胞破碎和分离.ppt

第三章 细胞的破碎与分离;本章的主要内容;概述;概述;大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。;细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。;微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 ;细菌细胞壁结构;细菌细胞壁结构;靴全锦肃海单偏闺俞辐逛然单哗甚沸伪卞隶赵骗谈法佬莽独寻藩揽旨蓉蹦第三章 细胞的破碎与分离第三章 细胞的破碎与分离;酵母细胞壁的结构示意图;真菌的细胞壁;细胞壁的组成和结构;细胞破碎技术;细胞破碎技术;细胞破碎技术;细胞破碎方法及其原理;一　机械法;进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。;Netzsch LM-20型珠磨机;珠磨机破碎作用方程;胶体磨;甘蔗叶片和茎总RNA的提取及mRNA的分离纯化 ;甘蔗叶片和茎mRNA呈弥撒分布，长度都分布在0.5～3 kb范围内，完全符合建库要求。 ;双链cDNA（dscDNA）的合成及检测 ;2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）;高压匀浆器的排出阀;影响高压匀浆器细胞破碎因素;易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌;大、中、小型高压匀浆器;超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。 ;超声波破碎的机理 一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation), 液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。 ;诡侄废仿伸呈滚课谣银趟人颂洼釜直孜徒逸肚存洱掺分璃克腑呻感佩卧队第三章 细胞的破碎与分离第三章 细胞的破碎与分离;超声波破碎的适用范围;机械法的缺点;二 非机械破碎方法;1.酶溶法（Enzymatic Lysis）;酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。;有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。;优点： 产品释放的选择性高；抽提的速率和收率高；产品的破坏最少；条件温和，对PH值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片。; （2）自溶法（Autolysis）;某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。;（1）酸、碱处理法;（2）表面活性剂;能被细胞壁脂质层吸收后，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。;通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% ； 有些化学试剂有毒 。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响 最终产物纯度。;2.物理法（Physical permeation）;1）渗透压冲击法 ; 2）冻结-融化法