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实验九 过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法 原 理： H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 材料与设备 实验材料: 海桐叶 操作步骤： 1．称取植物材料0.3g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲液 (pH7.0) 6ml(分三次加入，最后两次用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，以 6000r／min 离心15分钟，倾出上清液。 操作步骤： 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按下表顺序加入试剂。 操作步骤： 3．测定 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测2min，记录数据。 4.按下式计算酶活性。 作 业： 1.写实验报告 2.问题： ?（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? （2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关? * * 实验器材：紫外分光光度计；离心机；研钵；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴； 试 剂： O.1mol/L过氧化氢；，0.1mo1/L磷酸缓冲液,pH7.0、 pH7.8 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 1.0 1.0 1.0 蒸馏水(ml) 1.5 1.5 1.5 pH7.8磷酸(ml) 0.2 0.2 0.2 粗酶液(ml) S3 S2 S1 管? 号 结果计算： ??? 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 ????? 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 式中：? A240 = AS0- ????????? AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； ????????? AS1, AS2—样品管吸光值； ????????? Vt—粗酶提取液总体积（ml）； ????????? V1—测定用粗酶液体积（ml）； ????????? FW—样品鲜重（g）； ????????? 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； ????????? t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 *