淋巴细胞功能检测---.ppt

免疫学检测的临床应用（回顾） 认识、阐明相关疾病发病机制 诊断、辅助诊断相关疾病 免疫功能检测与监视 实验四 设计性实验：常见细胞免疫检测II 【实验任务】 市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑）。 【目的要求】 一、学会设计实验，从淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度证实某产品有免疫增强作用。 二、掌握淋巴细胞转化试验的原理及临床实用价值。 一、实验动物（如balb/c小鼠） 二、注射器、针头、10ml离心管、滴管、试管、玻片等常规实验仪器。 三、PHA、瑞氏姬姆萨染液，肝素，Hanks液等常规实验试剂。 【实验材料】 【作业】 请将你们小组的设计方案与技术路线在讨论完善后记录在实验报告本，并将可行的实验内容在实验课中实施。 实验动物分组 对照组、实验组处理因素干预 免疫功能检测指标确立 对照组、实验组机体免疫功能检测 一、讨论 （一）设计性方案要点 实验方案 （二）淋巴细胞功能检测的主要内容 T细胞功能测定 B细胞功能测定 单核巨噬细胞、NK细胞等功能测定 细胞因子的检测 CD分子、表面受体、粘附分子的检测 1、T细胞功能测定 （1）T细胞转化、增殖试验 ① H3-TdR掺入 ②细胞能量代谢测定（ MTT检测法） ③形态学计数 （2）迟发性超敏反应的检测 （3）T细胞分泌功能的检测 （4）流式细胞仪对T细胞功能的检测 （5）T细胞介导的细胞毒试验 T细胞转化、增殖试验:H3-TdR掺入 T细胞毒性试验 T PHA 母 测转化率 ConA 增殖 加H3-TdR T T T 测掺入量 CTL + 靶 -51Cr 靶细胞溶解， 51Cr释放 测放射活性 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 淋巴细胞功能的体内试验 结 核 菌 素 反 应 B 2、B细胞功能测定 溶血空斑试验 B 浆 + 温育 1-3h 绵羊红细胞 补体 有丝分裂原 浆 B + 溶血空斑实验 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） ①?稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞 3、细胞因子的检测 （1）免疫学检测法 （2）生物学活性检测法 （3）分子生物学测定法 细胞因子的检测有助于了解该细胞因子在免疫调节中的作用，以及鉴定分离提纯后的淋巴细胞的功能。 以细胞因子为抗原的检测法 测定细胞因子相关的生物学活性 用基因的技术检测细胞因子含量以及预测合成量 4、CKR 、CD、 AM 、表面受体的检测 检测方法目前大多采用间接荧光、FCM检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。 上述分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。 二、示教：淋巴细胞转化 测定淋巴细胞功能的一种方法。 人类T、B淋巴细胞表面有丝裂原受体，T、B淋巴细胞能分别与不同的丝裂原结合，发生淋巴细胞的转化增殖反应。 根据淋巴细胞转化率，可以间接判断机体免疫状态。 三、操作：淋巴细胞转化试验 （一）原理： T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异丝裂原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使细胞发生形态改变而转化为淋巴母细胞。 T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。 计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡型、母细胞和分裂相淋巴细胞。 细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或 某些其他疾病时，转化率明显降低。 淋巴细胞的转化标准 方法： 提前三天给小鼠注射PHA0.5ml，6mg/kg ，一天一次，连续三天。 剪断小鼠尾巴，向洁净载玻片上滴一滴血，用另一块洁净的推片以450角推成血膜（头、体、尾分明）。 干燥后，瑞氏姬姆萨染色：滴3-5滴A液于载玻片1min，6-10滴B液, 3min后充分水洗。 镜检，计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列（以减少推片中细胞分布不均的误差）。 How to make blood smears 血涂片质量评价 头体尾 分明 厚 薄 均 匀 长 度 适 中 计算 一般认为转化率的正常值为60～70% 推片 结果与结果分析 T PHA 母 ConA 增殖 细胞因子 T T T PHA 48~72 h 【思考题】 检测T、B淋巴细胞功能的实验主要有哪些？ 淋巴细胞转化试验有何临床实用意义? 影响淋巴细胞转化试验的因素有哪些? fighting * fighting *