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培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响 及两株新菌的初步鉴定毕业论文 目 录 摘要 I ABSTRACT III 符号与缩略语说明 VII 前言 IX 第一章 文献综述 1 一、土壤微生物的多样性 1 二、土壤微生物多样性的研究方法 4 三、未培养微生物的研究进展 12 四、微生物分类鉴定的研究方法 17 参考文献 20 第二章 培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响 29 1 材料与方法 29 2 结 果 33 3 讨 论 38 参考文献 40 第三章 Phycicoccus sp. TR6-7的初步鉴定 43 1 材料与方法 43 2 结果与分析 50 3 结果讨论 56 参考文献 58 第四章 Humihabitans sp. TR6-11的初步鉴定 61 2 结果与分析 62 3 结果讨论 66 参考文献 68 全文总结 71 创新之处 73 附录 I 攻读硕士学位期间发表的论文 73 附录II 文中所用的培养基和试剂配方 75 致 谢 77 提高土壤微生物的可培养性，获得纯培养微生物菌株，是微生物生态学研究的基础。目前由于技术手段的限制，以及人类认识水平的不足，使得自然界中微生物总数的99%还难以用纯培养技术获得分离和培养。因此研究和开发这99%的未培养微生物已成为国内外的一个热点。本论文采用三种营养物质浓度不同的培养基对土壤细菌进行分时段计数，以细菌通用引物扩增细菌16S rDNA片段，用限制性内切酶Hha I酶切PCR产物，对酶切图谱进行分型，研究了不同培养方法对土壤细菌多样性和可培养的影响；本论文还对从土壤中分离得到的两株与其相邻菌种具有较大差别的新菌株（标记为TR6-7和TR6-11）进行了初步鉴定。 结果表明，LB、CSEA、WSA培养基192 h后每g干土获得的细菌数量分别为14.84×107、10.27×107和6.91×107 CFU，但微生物多样性指数以WSA为最高，LB多样性指数最低；三种培养基培养的细菌菌群有一定的相似性，LB和CSEA培养基间的Jaccard指数为57.69%，LB和WSA培养基之间为53.13%，而CSEA和WSA培养基的相似性指数达66.67%；96～192 h细菌的丰富度最高，0～48 h细菌丰富度最低，并且三种培养基中单一OTUs类型的43.9%均是在96 h后才出现的。16S rDNA测序结果表明，所获得的土壤细菌优势种群在分类方面主要属于γ-和β-变形杆菌以及放线菌亚门，其中某些OTUs中的16S rDNA序列与Burkholderiaceae bacterium、Rhodococcus和Mycobacterium属具有较高的同源性，推测其细胞能够分泌复苏促进因子，有效地提高土壤细菌的可培养性。 TR6-7革兰氏染色反应呈阳性，呈椭圆状，无鞭毛和菌毛；最适生长温度为30℃，最适pH值为6.08，最适的盐浓度为2%，无Nacl等盐离子依赖性。TR6-7菌株不能使明胶液化，不能使淀粉水解， V.P.实验，不能使甲基红变红，不产生氨气，不产生吲哚，但能产生H2S，能使过氧化氢溶液产生小气泡，能使硝酸盐还原。TR6-7能利用蔗糖、半乳糖、果糖、麦牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖为唯一碳源生长，但不利用甘露醇和甜醇。TR6-7的主要脂肪酸为C22:1 w7c/22:3 w3c。TR6-7的16S rDNA序列与其最相邻Phycicoccus dokdonensis KCTC 19248T的同源性为97.2%。基于以上数据我们初步鉴定菌株TR6-7属于Phycicoccus属的一个新种，并命名为Phycicoccus sp.。 TR6-11革兰氏染色反应呈阳性，呈长杆状，无鞭毛和菌毛，无运动能力，好氧；在GPM、NA培养基上长势良好，最适生长温度为30℃，最适的盐浓度为0.5%，无Nacl等盐离子依赖性，最适pH值为6. 8。V.P.实验，不能使甲基红变红，不产生氨气，不产生吲哚，不能Tweens40，80，但Tweens20。TR6-11能产生H2S，能使明胶液化，能使淀粉水解，能使过氧化氢溶液产生小气泡，能使硝酸盐还原。能利用蔗糖、半乳糖、果糖、麦牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖、甘露醇、甜醇、鼠李糖为唯一碳源生长。TR6-11的主要脂肪酸为C22:1 w7c/22:3 w3c，C24:2 w6c。TR6-11的16S rDNA序列与其相邻的Humihabitans NRRL B-24470 T同源性为97.1%。基于以上数据我们初步鉴定菌株TR6-Humihabitans属的一个新种，并命名为Humihabitans sp.。 EFFECT OF CULTIVATION METHOD