细胞传代与活性检测.pptVIP

细胞传代培养及培养细胞的活性鉴定;实验原理 ;细胞活性测定 细胞活性测定的方法较多，如染料排斥法、FDA-PI双色荧光检测法和MTT检测法等都是常用的方法。 一、染料排斥法：是利用细胞损伤或死亡时，某些染料如台盼蓝、伊红Y、苯胺黑等可穿透变性的细胞膜，而活细胞的选择透性能阻止这类染料进入细胞。;实验器材及试剂 ;实验方法 细胞传代方法： 1．吸去培养单层细胞的细胞培养瓶或培养皿中的培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 2．加人0.25%胰蛋白酶工作液(25ml细胞培养瓶加入1ml)，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3．快速地前后旋转细胞培养瓶4～5次以使瓶内所有细胞能接触到胰蛋白酶。将细胞培养瓶盖松松拧上后置37℃培养箱中消化2～5分钟。 4．用手轻拍细胞培养瓶使得瓶内的少量液体能够带下已经要脱离瓶壁的细胞，放在倒置镜下观察细???检查细胞脱落情况。 5．若无细胞脱落将细胞培养瓶再放回37℃培养箱中孵育数分钟。继续轻拍细胞培养瓶直至细胞完全脱落，重悬细胞于细胞培养液内以终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化，吸除胰酶细胞消化液，根据细胞消化状态也可用D-Hanks液清洗一遍。;6．加入含血清的完全细胞培养液，轻轻吹打细胞使得团状细胞分散，可进行细胞计数，以需要的细胞密度进行细胞传代培养。 7．用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外2-3瓶中，旋好培养瓶盖，置37℃下继续培养。 细胞活性检测 8.将培养细胞制成单细胞悬液，取9滴细胞悬液移入离心管中，加一滴0.4％台盼蓝染液，混匀，在3分钟内，滴加细胞染色液于洁净载片，加上盖片显微观察，计算细胞存活率。其中活细胞拒染色，而死细胞被染成淡蓝色，细胞存活率(％) = 活细胞总数/死活细胞总数。 9．另吸取500μl 细胞悬液于离心管中，分别各加入100μlPI 和FDA并混匀，染色2-3分钟后，吸取染色细胞液于载片，加上盖片，打开荧光显微镜，蓝光激发下，观察细胞产生荧光现象。;板很锄叼漏奢冯粟奴宛奄泰孜痰垫携父椒稚贝丈妆诅挂疏守舌救卑芍棍体细胞传代和活性检测细胞传代和活性检测;FDA-PI 混合染色后，显示绿色的活细胞及桔红色的死细胞;实验注意事项： 1．在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被污染。2．胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加或减少胰酶用量。不同的细胞消化时间有所不同，否则细胞贴壁生长状况会较差。 3. 如果发现细胞消化时间过长，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。