基于人源Cdc25C蛋白融合表达探究.docVIP

基于人源Cdc25C蛋白融合表达探究材料与方法 1.材料：MCF-7细胞由本实验室保存；感受态大肠杆菌DH5alpha;、BL21及质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DMEM培养基购自GIBCO生物公司；胎牛血清为杭州江滨公司产品；ImPro-II逆转录试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自NEB公司；谷胱甘肽琼脂糖珠4B购自AmershamPharmaciaBiotechnology公司；辣根过氧化物酶标记的GST抗体、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP购自Sigma公司；引物合成和测序由北京奥科生物技术有限公司完成。 2.MCF-7细胞培养及总RNA提取：用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养MCF-7细胞。收集MCF-7细胞，计数，在约5times;106细胞中加入350mu;LRLT裂解液，充分混匀后加入等体积的70%乙醇，混匀并转移至RNA吸附柱中，8000r/min离心15s，弃上清液；加入700mu;LRW1液，8000r/min离心15s，弃上清液；加入500mu;LRPE液，8000r/min离心15s，弃上清液，重复1次；将吸附柱转移到一个新的2mL的离心管中，最大转速离心1min后加入30~50mu;L不含RNase的水，最大转速离心1min后，将RNA洗脱至1.5mL的EP管中。 3.RT-PCR扩增cdc25c基因：采用ImPro-II逆转录试剂盒，取1mu;gRNA为模板，以oligo（dT）15和随机引物逆转录合成cDNA（反应条件：25℃5min，42℃1h）。70℃、15min灭活反应体系中的逆转录酶和RNase抑制剂。以该cDNA为模板，以正向特异性引物5#39;-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3#39;（含BamHⅠ酶切位点）、反向引物5#39;-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3（#39;含XhoⅠ酶切位点）扩增cdc25c基因序列。将PCR扩增产物及载体pGEX-4T-1分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接，转化大肠杆菌感受态DH5alpha;，筛选阳性克隆进行酶切鉴定。 4.GST-Cdc25C蛋白的诱导表达：将pGEX-GST-Cdc25C质粒转化大肠杆菌感受态BL21，接种至氨苄西林抗性的LB培养基中，37℃、200r/min培养至D600nm为0.6~0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，12℃、200r/min培养6~8h，收获菌体，超声波低温破碎菌体，离心后取上清，加入4times;SDS上样缓冲液［200mmol/LTris-HCl（pH6.8），8%SDS，4%溴酚蓝，40%甘油、10%beta;-巯基乙醇］，沸水浴5min，将样品进行SDS。 5.GST-Cdc25C蛋白的纯化：在菌体上清中加入谷胱甘肽（GSH）琼脂糖珠4B，4℃旋转孵育2h，1000r/min离心，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，备用；分别向结合GST的GSH琼脂糖珠、与GST-Cdc25C结合的GSH琼脂糖珠中加入1times;SDS上样缓冲液［50mmol/LTris-HCl（pH6.8），2%SDS，1%溴酚蓝，10%甘油、2.5%beta;-巯基乙醇］，沸水浴5min，离心后取上清进行SDS。 6.免疫印迹分析：SDS结束后，将胶用半干转膜法转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1h，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的GST抗体，室温孵育1h，用PBST洗膜3次，每次5min，最后将含有辣根过氧化物酶底物的ECL滴加到膜上，在暗室中进行X线胶片显影。 7.磷酸酶活性分析：在300mu;L磷酸酶反应缓冲液［50mmol/LTris-HCl（pH8.0），50mmol/LNaCl，1.0mmol/LEDTA，5mmol/LDTT，0.1%BSA］中分别加入1mu;g纯化的GST蛋白和GST-Cdc25C蛋白，随后加入Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP（终浓度150mu;mol/L），37℃温育，用荧光分光分度计在490nm激发光波长、530nm发射光波长处检测反应产物的荧光强度，荧光强度值的增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。 结果 GST-Cdc25C融合表达质粒的构建：为了获得cdc25c基因，我们首先提取了MCF-7细胞总RNA，用RT-PCR逆转录获得MCF-7cDNA库，并用cdc25c特异性引物从cDNA库中扩增获得cdc25c基因，PCR产物电泳鉴定结果见图1。测序结果表明，该PCR产物序列与cdc25c基因序列（Gen