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尊敬的编辑部老师：您们好！ 我们已按照外审专家的意见，对文章进行了修改，修改部分用红色标注了。现对审稿人提出的意见逐条回答如下: 第一审稿人意见： 探索研究一种提exosome的方法具有鲜明的创新意义。但本文少有欠缺在于没用与经典的超速离心方法进行比较，也没有对效率进行评价研究，仅仅报道了可以提取出exosome，若能增加这些研究内容则更好。若既往未见超滤提取的报道，建议标题该为：“旋转超滤：一种提取细胞外泌体的新方法”。 100kDa NWCO超滤膜能够截留分子量在100Kda的物质，即相当于分子直径在40nm以上的物质，而分子量小于100KDa的物质被过滤除去，以达到提取exosome的目的。前期步骤如弃除细胞碎片等与经典的超速离心方法相同，文献中报道使用超速离心法从106个BMSCs的细胞培养基中提取约5.62μg exosome（见文中引用文献13），我们从每106个BMSCs的细胞培养基中平均能提取约7.2ug的exosome，由于旋转超滤避免了超速离心的高压力对微泡损害引起的损失，因此提取的exosome的exosome的报道，按照审稿人意见，我们将题目改为“旋转超滤：一种提取细胞外泌体的新方法 二、第二审稿人一审意见： 发明一种合适的外泌体分离和纯化的方法，保证外泌体的含量、纯度及生物活性，对深入开展外泌体特性及其功能的研究具有重要意义。因此，本文具有较好的创新性，但存在以下几方面的问题需要改进： 首先也是最重要的，作为一种可能的优化方案，除了在讨论中分析其他分离方法的缺陷和不足外，需要从外泌体的含量、纯度及生物活性等三方面数据与其他实验方案进行比较，才能体现新方法的优越性（其他方案的数据可以引用文献）。本文没有生物活性的实验数据，这需要补充。 106个BMSCs的细胞培养基中提取约5.62μg exosome（见文中引用文献13），我们从每106个BMSCs的细胞培养基中平均能提取约7.2ug的exosome，由于我们避免了超速离心的高压力对微泡损害引起的损失，因此提取量及质量应该优于超速离心方法。 我们提取的exosome是具有生物活性的，有关这点，已在文章中进行了补充。我们使用cck8试剂研究不同剂量exosome（0、5、10、20、200ug/ml）对人脐静脉内皮细胞增殖作用的影响时发现，exosome是具有促进内皮细胞增殖的作用的，在一定浓度范围内，随着exosome剂量的增加，促增殖作用逐渐增强，说明通过旋转超滤技术能够提取到具有生物活性的exosome。 ＜2＞微泡的直径是50nm-1000nm，和外泌体的40nm-100nm大小有重叠，甚至有的方案获得的外泌体实际主要是微泡。本文需要说明如何排除微泡的污染？ hedding vesicles or Microparticles）的直径为100-1000nm（见文章中参考文献16，17），我们使用旋转超滤方法前经过0.22um滤器过滤，排除了直径220nm及以上的微泡，但是对于直径100-220nm的微泡，并不能够排除，而传统的超速离心方法同样也存在这个问题的困扰，因此需要进一步的提纯方法才能得到纯度高的外泌体，我们通过透射电子显微镜发现提取的微泡直径约100nm，并且蛋白质免疫印迹法能够检测出exosome特异性表面标志CD63,CD9，提示旋转超滤法能够提取exosome，但若要彻底排除一些微泡的干扰，还需进一步的进行纯化。我们的方法主要优势在于使用简单的方法代替超速离心技术来获得exosome，这避免了对超速离心机的依赖，有利于exosome研究的普及。 ＜3＞对于旋转超滤方案是否有相关文献报道？这意味着着本文的创新性，而本文前言和讨论中均未提及。旋转超滤仪器等配置是否具有价格优势，也是需要说明的地方。另外，本文仅用了MSC细胞分离外泌体，并无应用到其他细胞，建议进行对此进行说明，否则该方案不具有通用性。 Millipore公司，按选购的滤器直径不同价格也不同，价格约4000-10000元不等，而使用的压力来源与高纯氮气，这在我们医院有提供，而且一般研究机构都有提供，因此并不需要特别高昂的设备，这相对于超速离心机的高昂价格和低普及率，具有明显的优势。 本文中我们使用BMSCs作为细胞来源来检测旋转超滤技术能否提取外泌体，尽管不同细胞外泌体内成分不同，产量也不同，但是外泌体的直径是40-100nm这具有普遍性，我们是依赖外泌体的分子大小这一物理原理来提取外泌体，而不是依赖受体配体结合的原理来提取，因此和超速离心一样，通过旋转超滤法提取外泌体具有普遍性。 非常感谢审稿专家的宝贵意见及编辑部老师们的支持帮助！ 作者：胡国文等