参考-氯酚对碱性磷酸酶的抑制动力学研究.docVIP

氯酚对碱性磷酸酶的抑制动力学研究 摘要：采用分光光度法研究了2-氯酚2-CP)及4-氯酚4-CP)对碱性磷酸酶ALP)活性的抑制作用及抑制动力学. 结果表明, 2种氯酚均可明显抑制ALP的活力, 2-CP及4-CP对ALP酶活力的50%抑制浓度IC50)分别为23.29 mmol·L-1和30.02 mmol·L-1. Lineweaver-Burk双倒数曲线ALP的表观米氏常数Km最大反应速率Vmax0.124 mmol·L-1和1.80 μmol·L-1·min-1. 分别加入2-CP及4-CP后表观米氏常数和表观最大反应速率均降低表明2-CP及4-CP对ALP的抑制作用类型为反竞争性的可逆抑制, 2种氯酚通过与酶-底物复合物作用而抑制酶的催化活性. 2-CP及4-CP对ALP的抑制常数Ki分别为18.89 mmol·L-1和32.68 mmol·L-1, 2-CP比4-CPALP呈现更强的抑制作用. Inhibition Kinetics of Chlorophenols on alkaline phosphatase 氯酚(chlorophenols)广泛用于农药、杀菌剂、医药、造纸、防腐剂等工业, 属典型的持久性有机污染物, 进入环境后, 可在环境中长期残留, 对生态系统和人类的健康造成严重威胁, 很多氯酚化合物已被各国环境保护部门列为环境优先污染物[1,2]. 氯酚类污染物的毒性效应及其降解一直是国内外研究的热点[3~6]. 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP, EC 3.1.3.1)是广泛存在于生物体内的非特异性磷酸单酯水解酶, 它是哺乳动物生理过程中一种非常重要的酶, 被用于很多疾病的辅助诊断[7-9]. ALP也广泛存在于水体和土壤环境中, 监测其活性对于指示环境污染的程度有重要意义。关于污染物对ALP活性抑制作用的研究报道较多, 刘斌等[10]的研究表明联苯胺是ALP的竞争性抑制剂, Me?trovicPavela-Vrancic [11]的研究表明冈田酸是ALP的非竞争性抑制剂耿芳宋等[12]的研究表明五氯酚是ALP的反竞争性抑制剂, WhisnantGilman [13]的研究表明乙二胺四乙酸是ALP的不可逆抑制剂 可见不同性质的小分子对ALP呈现不同的抑制作用机制. 目前, 尚未见2-氯酚及4-氯酚对ALP抑制作用方面的研究报道. 本文探讨2-氯酚及4-氯酚对ALP的抑制效应及其抑制动力学, 旨在为氯酚类污染物的安全使用及其生物毒性评价提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 配有恒温装置的722E型分光光度计(上海光谱仪器有限公司), SDC-6低温恒温槽(宁波新芝生物科技股份有限公司), 1810a超纯水器(上海摩勒科学仪器公司), PHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂). 碱性磷酸酶(ALP, 活力 ≥ 10 DEA/mg, 来源于牛肠黏膜)及对硝基苯磷酸二钠(p-NPP, ≥99%)购自美国Sigma公司; 三羟基氨甲基(Tris base, Ultra Pure Grade, 99.9%)购自美国Amresco公司; 2-CP及4-CP购自国药集团化学试剂有限公司. 所用试剂均为分析纯, 实验用水为无菌超纯水. 1.2 实验方法 1.2.1 溶液配制 用0.1mol·L-1 HCl盐酸将0.1mol·L-1 Tris溶液的pH值调节为9.8, 即得到pH为9.8的Tris-HCl缓冲溶液. 用Tris-HCl缓冲溶液配制浓度为5.0×10-5 mol·L-1的ALP贮备液, 冷冻储存, 使用时用Tris-HCl缓冲溶液稀释成所需浓度的使用液; 用超纯水配制浓度为0.20 mol·L-1的p-NPP贮备液, 用时稀释至所需浓度的使用液; 用无水乙醇配制1.0mol·L-1 的2-CP及4-CP贮备液; 用超纯水配制浓度为0.10 mol·L-1 的MgCl2溶液. 1.2.2 ALP活力的测定 用分光光度法测定ALP的活力. ALP催化底物p-NPP的水解产物对硝基苯酚在400～410 nm范围有较大吸收, 在本实验条件下对硝基苯酚的最大吸收波长为405 nm, 通过测定405 nm处水解产物吸光度值的变化来测定酶活力. 对照组ALP活力的测定: 在5 mL比色管中加入3.0 mL Tris-HCl缓冲溶液、0.10 mL MgCl2激活剂及一定体积的p-NPP使用液, 于37 ℃水浴中恒温5 min, 然后加入一定体积的ALP使用液, 迅速用缓冲溶液定容至5.0 mL, 摇匀, 开始计时. 于37 ℃水浴中恒温反应一定时间后, 以蒸馏水为参比, 在波长405 nm处测定其吸光度值(Acontrol). 以Tris-HCl缓冲溶液代