哺乳动物上皮细胞抗菌肽分离纯化技术研究进展.docVIP

Progress in Veterinary Medicine 哺乳动物上皮细胞抗菌肽分离纯化技术研究进展 (1.石河子大学动物科技学院 ,新疆石河子 832000 ; 2.新疆生产建设兵团农垦科学院绵羊繁育生物技术重点实验室 ,新疆石河子 832000) 中图分类号 : S852. 2文献标识码 :A 菌肽对疱疹病毒、感病毒、滋病病毒等有囊膜病 毒有明显的杀伤力。不易产生耐药性。相对传统 的抗生素而言 ,细菌对抗菌肽更难产生耐药性。 抗肿瘤活性。使肿瘤细胞不能贴壁和正常生长。 无残留、毒副作用。 机制独特等特点。文章主要综述了几种哺乳 动物上皮细胞抗菌肽的分离纯化技术研究概 哺乳动物抗菌肽研究起步较杀菌肽 (cecropin)、 况。 fensin)晚 ,但是发展速度较快 ,至今已经分离纯化或 克隆得到数百种哺乳动物上皮细胞抗菌肽。 哺乳动物的皮肤和黏膜直接与外界接触 ,是病 原体入侵的门户 ,为了抵御病原体的入侵 ,当机体受 病原微生物刺激后在上皮细胞 (气管、和小肠等黏 抗菌肽 ( t racheal antimicro bial peptide , TA P)、舌抗 生物入侵的第一道分子屏障 ,也是生物体先天性免 疫的重要组成部分 [ 3 ]。抗菌肽具有抗细菌、菌、 虫和一些有被膜病毒的作用 ,作用机制独特 ,不易产 pep tidoglycan ( P GN ) reco gnitio n p roteins , 阔的应用前景 [ 4 ] ,故从不同的哺乳动物上皮细胞中 分离纯化具有抗菌活性的多肽是研究的重点。 它是从哺乳动物上皮细胞分离纯化得到的第一个抗 1. 1　抗菌肽的理化特点菌肽 , TA P的发现为其他的哺乳动物上皮细胞抗菌 抗菌肽的理化性质主要有以下几点 :分子质 量小 ,氨基酸组成少于 100个。热稳定性高 , 100加热 10 min～15 mim ,仍能保持一定的活力。 水溶性好。等电点 (p I)一般大于 7 ,具有较强的 阳离子特征。 1. 2　抗菌肽的生物功能特点提。纯化采用 3步色谱技术 ,第一步凝胶过滤色谱 抗菌肽的生物功能特点主要有 :广谱高效的 抗菌活性。抗菌肽对革兰氏阳性菌、兰氏阴性菌、 真菌及原虫均有高效广谱的杀伤作用 ,并且它的抗的柱子 ,用 50 mmol/ L的乙酸铵 ( p H 4. 1 )平衡、 菌浓度小 ,一般在微摩尔水平。抗病毒活性。抗 2. 5 mL/ min流速洗脱 ,收集、冷冻干燥并做抑菌试 基金项目 :兵团科技局基础研究项目 (2006J C01) 作者简介 :陈　琛 (1978 - ) ,男 ,陕西宝鸡人 ,硕士研究生 ,主要从事动物传染病诊断与防制研究。3通讯作者 30  动物医学进展　2006年　第 27卷　第 11期 (总第 158期)  验。有活性部分进行阳离子交换色谱 ,用 330 g/ L KH 2 PO 4溶液平衡 ,0 mol/ L～ 1 mol/ L的 NaCl线 性梯度洗脱 ,收集冷冻干燥。将有抗菌活性的部分 H PL C) ,0. 46 cm×22 cm C18反相柱 ,平衡 1 mL/ L 三氟乙酸 ( TFA )水溶液 ,洗脱 1 g/ L TFA/乙腈 ,乙 腈梯度0 mL/ L～ 850 mL/ L ,洗脱速度 1 mL/ min , 收集进行活性检测、子量鉴定及序列测定。 [9 ] 行质谱分析 ,氨基酸测序。B P GRPs的纯化则先将 粗提产物采用 10 cm× 25 cm C18 cat ridge进行浓 溶液 ,洗脱 1 mL/ L TFA/乙腈 ,乙腈梯度 0 mL/ L～ [ 10 ] 2. 2　绵羊上皮细胞抗菌肽分离纯化 绵羊抗菌肽包括 3类共 11种。这 3类分别是 防御素 ( defensin) Cat helicidins、羊肺部表面活性 peptides , SAA Ps)。截止目前 ,这 11种绵羊抗菌肽 中 Cat helicidins类的 SMA P29和 SMA P34已能人 工化学合成 ; OaBac5从绵羊中性粒细胞中分离纯 化 ,SAA Ps从绵羊肺部分离纯化 ,其他 7种均为克 隆得到的 cDNA序列 ,还没有从蛋白质水平分离纯 化得到。 SAA Ps分离纯化方法如下 [ 11 ] :用蒸馏水冲洗绵 羊肺脏 ,收集冲洗液 ,在 4℃以 30 000 r/ min离心 1 h。清液用高压液相色谱纯化 ,0. 39 cm×30 cm C18柱 ,0. 1 % TFA、10 %～ 100 %乙腈 ,梯度洗脱 , 洗脱速度 1 mL/ min。213 nm～217 nm波长测定吸 光度 ,收集洗脱液进行抑菌活性检测 ,氨基酸序列测 定 ,最后得到仅含 7个氨基酸的 SAA Ps。 2.